单细胞水平的测序技术发展的越来越快，目前应用最多的是集中于mRNA表达的scRNA-seq和结合了空间信息的空间转录组。在此基础上，还发展出了其他变种，比如snRNA-seq，scTCR/BCR-seq, scCITE-seq，ECCITE-seq，SPARC-seq，scATAC-seq，等等。这些测序手段越来越成熟和细分。不同的测序手段适用于不同的情况，研究者们需要综合考虑样本来源、处理方法、研究目的、实验费用等因素后选择适合自己课题的测序方案。

研究癌症谱系进化可关注的不同水平的测序技术[3]

代表性的单细胞多组学测序方法[4]

接下来的一段时间，我们计划深入解读以上提到的几种常用的单细胞组学测序方法，包括目的、测序原理、经典文章解读、数据分析工具、图表复现等方面。欢迎大家持续关注！

Why scCITE-seq：在单细胞组学技术出现之前，想要研究单个细胞的活性和功能，通常是使用一组细胞表面蛋白的免疫荧光抗体通过流式细胞等技术来检测细胞蛋白表达。目前常规的scRNA-seq虽然能够高通量的轻松测到成千上万个细胞内的几乎所有mRNA的表达水平，但是它却反而无法得到那些早期技术能得到的信息：细胞表面蛋白的表达水平。细胞功能的发挥最终还是落脚到蛋白上。而从mRNA到蛋白还会受到复杂的转录后调控，这导致了mRNA水平和蛋白水平的差异，即mRNA表达不能精确反应当前蛋白丰度水平。有文献表明蛋白表达差异整体低于mRNA差异[5]。这强调了同时考虑蛋白和mRNA表达水平的重要性。

What is scCITE-seq：CITE-seq全称为：Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing，是纽约基因组中心技术创新实验室与Satija实验室合作开发的一种多模式单细胞表型检测方法(a multimodal single cell phenotyping method)[6]。它的出现弥补了scRNA-seq无法同时获得单个细胞的mRNA和细胞表面蛋白（注意：该技术仅检测细胞表面蛋白，不考虑胞内蛋白）表达的缺点。该技术通过带DNA标签的抗体来检测细胞表面蛋白，同时用10x的RNA单细胞测序来检测全部的mRNA，从而完成同时获得mRNA和膜蛋白表达两个维度的信息。（注意本文中的CITE-seq和scCITE-seq是相同含义）

测序原理

CITE-seq的关键是引入了带DNA barcode的抗体：

该抗体连接了PCR扩增引物（PCR handle）、用于识别抗体身份的DNA barcode、和poly A尾。抗体与寡核苷酸的5’端通过链霉素-生物素亲和反应连接起来，并形成一个二硫键，还原剂可将寡核苷酸和抗体分离开。

将这种抗体和细胞悬浮液共孵育，等抗体和对应的细胞表面蛋白通过抗原-抗体特异性反应充分结合后，洗掉没有结合上抗原的游离抗体。此时得到的单细胞悬液中，每个细胞的表面蛋白都与对应的带DNA标签的抗体结合了。接下来将结合了抗体的细胞和带有条形码的凝胶微珠经由微流体“双十字”交叉系统形成油包水的微滴(droplet)，获得单细胞反应体系。然后将微滴中的细胞裂解，从而让细胞内的mRNA和细胞表面蛋白抗体的DNA序列（poly A尾的存在让抗体上的DNA标签能如同mRNA一样和凝珠上的poly T序列结合）和凝胶珠上的引物结合。最后通过文库制备过程后进行测序。

CITE-seq文库制备过程

疑问与解答

测了mRNA还不够吗？为什么还要测细胞表面蛋白？

从mRNA到蛋白出现在细胞表面还有很长一段过程，这导致了两者之间可能是不一致的。相对而言，蛋白比mRNA更能反应细胞目前的状态。因而同时测蛋白和mRNA可以提供不同且互补的信息来更好的判断细胞的功能和活性。除此之外，表面蛋白表达数据可以帮助细胞分类，提高细胞类型识别准确度。

CITE-seq一次可以测多少种抗体？

理论上来说使用的抗体种类数量是没有上限的。数量远远超过流式细胞仪的荧光团数量或质谱仪的同位素数量。但是要考虑到抗体太多导致费用更多等其他问题。目前CITE-seq常见的检测蛋白数量是100-200个左右。

示例文献

https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1

这篇文献中，同时使用了scRNA-seq, CITE-seq和空间转录组。这里我们只关注CITE-seq的部分：

用scRNA-seq数据对基质细胞进行聚类（a）和经典marker展示（b）

用CITE-seq数据展示相同细胞内部分marker蛋白的表达（i）用marker基因的蛋白表达值可将细胞按类型聚类（j），两个图均验证了两种数据间的一致性。

看下方法学：

这篇文章只对26个样本中的4个样本进行了CITE-seq测序，检测了157个细胞表面蛋白的表达。但是后续使用了Seurat的anchoring-based transfer learning算法用4个样本的CITE-seq值计算出所有剩余没有进行CITE-seq的样本对应膜蛋白的表达值。

下期预告

• 示例文献解读以及结果复现
• scCITE-seq测序数据分析：CITE-seq-Count
• scCITE-seq数据下游分析：Seurat

Reference

[1]https://www.jianshu.com/p/442d890d12ea

[2]https://www.bilibili.com/video/av328984786/?vd_source=0678d16c91cefd3d36645d90da8ed188

[3]Nam, A. S., Chaligne, R., & Landau, D. A. (2021). Integrating genetic and non-genetic determinants of cancer evolution by single-cell multi-omics. Nature reviews. Genetics, 22(1), 3–18. https://doi.org/10.1038/s41576-020-0265-5

[4]Kashima, Y., Sakamoto, Y., Kaneko, K. et al. Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analyses. Exp Mol Med52, 1419–1427 (2020). https://doi.org/10.1038/s12276-020-00499-2

[5]Reimegård, J., Tarbier, M., Danielsson, M. et al. A combined approach for single-cell mRNA and intracellular protein expression analysis. Commun Biol**4, **624 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02142-w

[6]https://cite-seq.com/

[7]Wu, S.Z., Al-Eryani, G., Roden, D.L. et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet**53, **1334–1347 (2021). https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1

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