http://mooc.guokr.com/note/16694/
1.1 介绍
1.2 DNA结构
1.3 DNA复制
快速、完全、精确
1.4 The Chemistry of DNA Replication
DNA聚合酶催化了反应进行
PTJ:primer template junction
引物的3‘端被延长
1.5The DNA Polymerase Active Site
DNA聚合酶催化至少16种反应,但只有一个活性位点
1.6The Structure of DNA Polymerase
1.7Catalysis by the Fingers of DNA Polymerase
1.8Mistakes by DNA Polymerase
每合成十万对碱基会发生一个错误
1.9校对核酸外切酶Proofreading Exonucleases
修正错误:移除错配的核苷酸
2.1Incorporation Assay核素掺入法
检测DNA活性的方法。检测聚合物的合成情况。
标记dNTP,可以用荧光或放射性标记。在每个时间点加入SDS或EDTA来终止反应。从dNTP中分离DNA并测量其中包含了多少标记的dNTP。那么怎样从dNTP中分离DNA呢?需要用到下面的方法:
2.2Filter Binding Incorporation Assay
把dNTP根据电荷从滤纸上洗脱。因为DNA不容易被洗脱,而dNTP容易被洗脱
2.3Electrophoresis Incorporation Assays凝胶电泳
- 加热将DNA变性
- 如果是琼脂糖ararose则添加NaOH,如果是聚丙烯酰胺,则添加尿素。为了防止退火
- 可以看到产物的长度,但比较慢
2.4引物延伸实验Primer Extension Assay
2.5持续合成能力Processivity
是与聚合物酶相关的能力。与每个聚合物分子结合的酶的反应循环数。
2.6DNA Polymerase Processivity Assay
模板竞争分析,测定持续合成能力。只测量第一次合成的情况。