老年骨质疏松症主要由成骨细胞功能衰减引起，进而导致骨量减少和骨重塑过程破坏。目前许多研究表明m6A修饰在骨质疏松症的调控中发挥着重要作用，但大多数研究集中在骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用上，而m6A对成骨细胞的直接调控机制尚不清楚。
兰州大学第二医院骨科夏亚一教授和耿彬教授合作，在老年骨质疏松症患者中揭示了m6A修饰和甲基转移酶样3（METTL3）表达降低。进一步体外实验表明，METTL3抑制了成骨细胞衰老，而成骨细胞功能障碍会影响骨代谢平衡。随后MeRIP-seq和mRNA-seq联合揭示了METTL3调控Hspa1a转录本的稳定性。在METTL3抑制成骨细胞衰老过程中，YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）延缓了Hspa1a mRNA的衰减。METTL3在小鼠成骨细胞中特异性过表达，进一步证实METTL3可以抑制老年骨质疏松症的进展。相关研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”为题发表在《cell death discovery》期刊上。
标题：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介导的m6A修饰可增加Hspa1a稳定性以抑制成骨细胞衰老）
时间：2024.3.27
期刊：cell death discovery
影响因子：IF 7/ 2区
实验方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光和组织学染色等
研究摘要：
本研究揭示了老年骨质疏松症的进展与m6A修饰和METTL3下调密切相关。METTL3过表达可以抑制成骨细胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通过上调Hspa1a mRNA的稳定性来抑制成骨细胞衰老。此外，结果表明METTL3通过m6A修饰增强Hspa1a
mRNA的稳定性来调控成骨细胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）参与METTL3介导的m6A修饰过程中Hspa1a mRNA的稳定。从机制上讲，METTL3以YTHDF2依赖性方式增加Hspa1a
mRNA的稳定性，以抑制成骨细胞衰老。本研究结果证实了METTL3在成骨细胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨质疏松症的潜在治疗靶点。
结果图形：
（1）老年骨质疏松症中m6A修饰减少
为了研究与年龄相关的骨质流失与 m6A 修饰之间的关系，进行比色法检测骨组织中的m6A水平。检测结果在老年骨质疏松症患者的骨组织中观察到m6A修饰水平显著降低（图1）。由于m6A修饰主要受甲基转移酶和去甲基化酶调控，因此在骨组织中检测METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。
（2）METTL3 抑制体外成骨细胞衰老
在衰老过程中，骨微环境中的各种细胞类型都会经历衰老，导致骨形成减少和骨的负平衡。为了研究成骨细胞衰老是否归因于m6A修饰减少和METTL3表达降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并从C57/BL6小鼠的原代成骨细胞中敲低了METTL3。
（3）成骨细胞功能对体外骨微环境代谢的影响
（4）MeRIP-seq揭示METTL3调控Hspa1a稳定性
为研究METTL3在调控成骨细胞衰老中的潜在分子机制，研究人员在MC3T3-E1细胞中激活METTL3后，进行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序）和mRNA-seq（mRNA测序）。实验结果表明，在MC3T3-E1细胞中鉴定的m6A位点在“GGAC”序列中富集（图4a），大部分m6A位点位于编码序列（CDS）和3'非翻译区（3'UTR）。Metagene分析显示m6A位点主要位于终止密码子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鉴定出13个共有显著基因。验证了7个显著上调的潜在靶标，qRT-PCR结果显示Nr4a3和Hspa1a上调更为显著（图4b）。在Hspa1a终止密码子附近发现m6A峰的高丰度和特异性，表明Hspa1a可能是成骨细胞衰老的关键调控因子（图4c）。通过SRAMP数据库预测揭示Hspa1a mRNA中的多个高度可靠的m6A修饰位点。在METTL3沉默的MC3T3-E1细胞系和原代成骨细胞中，Hspa1a蛋白表达水平显著下调（图4d）。免疫荧光结果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表达下调（图4e）。RIP-qPCR结果证实Hspa1a mRNA能直接与METTL3蛋白结合（图4f）。MeRIP-qPCR验证了在METTL3沉默的细胞系中Hspa1a mRNA的m6A修饰水平显著降低（图4g）。随后进行RNA稳定性实验以分析METTL3介导的m6A修饰对Hspa1a表达调控作用机制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰减速度显著快于对照组（图4h）。这些结果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的稳定性并减少了其衰减。通过以上实验，研究人员揭示了METTL3通过m6A修饰正向调控Hspa1a mRNA稳定性的机制，并揭示METTL3可能通过这一机制抑制成骨细胞衰老。
（5）METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰变
（6）靶向成骨细胞中的METTL3可抑制老年性骨质疏松症进展
参考文献：
WangY, Chen Y, Xiao H, Liu Z, Liu X, Feng Z, Sheng X, Peng B, Ren X, Xu L, Teng F,Yi Z, Niu Y, Xiang D, Xia Y, Geng B. METTL3-mediated m6A modification increasesHspa1a stability to inhibit osteoblast aging. Cell Death Discov. 2024 Mar27;10(1):155. pii: 10.1038/s41420-024-01925-4. doi: 10.1038/s41420-024-01925-4.PubMed PMID: 38538596.
