癌症一直是生物学研究的热门话题。关于癌症起源，一种主流观点是癌症干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）的无限增殖。CSC是肿瘤内肿瘤细胞的一个亚类，具有自我更新和异常分化能力。CSC不仅调控肿瘤的发生、传播和维持，还有助于肿瘤的化疗耐药性和复发。因此迫切需要探索影响生物活性的因素，特别是CSC分化。长链非编码RNA（lncRNA）作为基因表达的调控因子，在CSCs的细胞活性中起着关键作用。然而RNA（特别是lncRNA）的表观遗传调控机制尚未得到广泛探索。

N6-甲基腺苷（m6A）可逆修饰在转录后和翻译调控中起着至关重要的作用。m6A修饰对干细胞和癌症干细胞的干性维持和分化具有显著影响。但lncRNA的m6A修饰及其对CSC的影响仍未探索。

浙江大学生命科学学院章晓波教授团队对胃癌（GC）患者中分离的胃癌干细胞（GCSCs）和胃癌非干细胞（GCNSCs）的lncRNA m6A修饰差异进行表征，揭示了位点特异性lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG m6A修饰通过增加miRNAs和蛋白质的稳定性，抑制凋亡和促进增殖，从而促进GCSCs的肿瘤发生。相关研究成果以“Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis”为题发表在《Cellular & Molecular Biology Letters》杂志。

标题：Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis（甲基化的lncRNA通过lncRNA-miRNA/蛋白轴抑制胃癌干细胞的凋亡）

时间：2024.4.10

期刊：Cellular & Molecular Biology Letters

影响因子：IF 8.3 / 1区

实验方法：MeRIP-seq、MeRIP-qPCR等

研究摘要：

背景：长链非编码RNA（lncRNA）在胃癌的肿瘤发生中起着至关重要的作用。然而，lncRNA甲基化对胃癌干细胞（GCSC）的影响尚不清楚。

目的：探究lncRNA甲基化在GCSCs中的作用及其对胃癌发生的贡献。

方法：

1)     通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）检测胃癌干细胞中lncRNA的N6-甲基腺苷（m6A）水平，并通过MeRIP定量聚合酶链反应（MeRIP-qPCR）进行验证。

2) 通过基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增（SELECT）检测lncRNA上m6A特异性修饰位点。

3)  构建并转染与催化失活的Cas13（dCas13b）融合蛋白的表达甲基转移酶样3（METTL3）质粒，并诱导靶向lncRNA特异性甲基化位点的RNA，获得具有lncRNAs位点特异性甲基化的胃癌干细胞。

4)    使用逆转录(RT)-qPCR和Western blot分析处理后的胃癌干细胞的细胞干性（stemness）。

结果：

PSMA3-AS1和MIR22HG的位点特异性甲基化抑制了GCSCs的细胞凋亡并促进其细胞干性。

LncRNA甲基化增强了PSMA3-AS1和MIR22HG的稳定性，通过PSMA3-AS1–miR-411-3p–或MIR22HG–miR-24-3p–SERTAD1轴抑制GCSC的凋亡。

甲基化的lncRNAs促进了PSMA3-AS1与EEF1A1蛋白或MIR22HG与LRPPRC蛋白之间的相互作用，稳定了蛋白并抑制细胞凋亡。

体内数据显示，甲基化的PSMA3-AS1和MIR22HG触发了GCSCs的肿瘤发生。

结论：

本研究揭示了lncRNAs位点特异性甲基化在GCSCs肿瘤发生中的必要性，为癌症发展提供了新的见解。

结果图形：

（1）GCSC中的lncRNA m6A甲基化

图1：GCSC中的N6-甲基腺苷lncRNA。 A. GCSC和GCNSC肿瘤球形成百分比。 B. GCSC的单个细胞的肿瘤球形成分析。 C. 用Western blot检测GCSCs和GCNSCs中干性基因的表达。 D. GCSC迁移的效率。对GCSC和GCNSC进行Transwell迁移测定以检查细胞迁移。 E. GCSC的化学抗性。用不同浓度的顺铂处理GCSC或GCNSC。处理后48小时，对细胞进行细胞活力测定（**p<0.01）。计算半数最大抑制浓度（IC50）值。 F. GCSC和GNCSC中RNA的m6A修饰。 G. GCSC和GNCSC中差异表达的m6A修饰 lncRNA热图。 H. 甲基化lncRNAs在GCNSCs和GCSCs中的表达谱。**p<0.01

（2）GCSCs中的lncRNA甲基化机制

图2：GCSC中的lncRNA甲基化机制。 A. 从HGC-27（GCSC-HGC）和MGC-803（GCSC-MGC）分选的GCSC单个细胞的肿瘤球形成测定。 B. GCSC-HGC和GCSC-MGC中干性基因的Western blot分析。 C. GCSC（GCSC-HGC和GCSC-MGC）的迁移能力。用Transwell迁移测定法分析GCSC-HGC、GCNSC-HGC、GCSC-MGC和GCNSC-MGC以检查细胞迁移。迁移细胞的代表性图像显示在左侧。迁移细胞的百分比显示在右侧（**p<0.01）。 D. GCSC（GCSC-HGC和GCSC-MGC）的化学抗性效率。用不同浓度的顺铂处理GCSC或GCNSC。处理后48小时，用细胞活力测定（**，p < 0.01）。计算半数最大抑制浓度（IC50）值。 E. 检查GCSC中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达。 F. 用METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救GCSC中METTL3的Western blot。 G. 具有METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救的GCSC中lncRNA的m6A水平。 H. 使用Western blot检测METTL3沉默或拯救的GCSC中干性基因的表达。β-tubulin蛋白用作对照。 I. METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救GCSC中METTL14的Western blot。 J. 使用METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救的GCSC中lncRNA的m6A水平。 K. 通过Western blot检测METTL14沉默或拯救的GCSC中干性基因的表达。**p<0.01

（3）甲基化lncRNAs在GCSCs中的作用

图3：甲基化lncRNA在GCSC中的作用。 A. GCSC中六种lncRNA（PAPPA-AS1、PSMA3-AS1、MIR22HG、LINC00342、LINC01410和LINC00680）的表达谱。 B. 验证GCSC中lncRNA沉默。 C. 用lncRNAs siRNA检测GCSCs中干细胞基因的表达。 D. PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSCs的细胞活力。 E. PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC的细胞周期分析。 F. 用于PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC的Caspase-3/7检测。 G. 预测lncRNA的甲基化位点。 H. GCSC和GCNSC之间lncRNA的m6A水平。 I. METTL3沉默的GCSC的m6A水平与lncRNA的位点特异性甲基化。 J. 具有lncRNA位点特异性甲基化的METTL3沉默的GCSC的细胞活力。 K. 具有lncRNA位点特异性甲基化的METTL3沉默的GCSC的细胞周期分析。 L. 用于METTL3沉默的GCSC的Caspase-3/7检测，其具有lncRNA的位点特异性甲基化。 M. Western blot检测METTL3沉默的GCSCs的干细胞基因与lncRNAs的位点特异性甲基化。 N. lncRNA位点特异性甲基化的METTL3沉默的GCSC的肿瘤球形成百分比。 O. 用甲基化的lncRNA对METTL3沉默的GCSC的单细胞进行肿瘤球形成检测。**p<0.01

（4）m6A修饰对lncRNAs稳定性的影响

图4：m6A修饰对lncRNA稳定性的影响。 A. METTL3沉默的GCSC中lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG的相对表达水平。 B. 用放线菌素D处理METTL3沉默的GCSCs的lncRNAs稳定性。

 （5）lncRNAs在GCSCs中的潜在机制

图5：GCSC中lncRNA的潜在机制。 A. GCSC中的lncRNA-miRNA互作的相对富集。 B. 双荧光素酶报告基因检测GCSC中潜在的miRNA-lncRNA互作。 C. miR-411-3p和miR-24-3p在GCSCs和GCNSCs中的表达谱。 D. 使用microT、miRmap和TargetScan预测miRNA的潜在靶基因。 E. 验证GCSC中miRNA的过表达。 F. 检测miRNA过表达的GCSC中靶基因表达水平。 G. 通过双荧光素酶报告基因测定验证miRNA与靶基因的互作。 H. GCSCs和GCNSCs中miRNA靶基因的表达水平。 I. GCSC和GCNSC中miRNA靶基因的Western Blot。 J. 用于AP1G1或SERTAD1沉默GCSC的Caspase-3/7检测。 K. Western Blot分析AP1G1或SERTAD1沉默GCSC中的干性基因。 L. PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中AP1G1或SERTAD1的表达水平。 M. Western Blot分析PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC中miRNA的靶基因。**p<0.01

（6）m6A修饰的lncRNA与蛋白质互作

图6：m6A修饰的lncRNA与蛋白质互作。 A. 用于lncRNA下拉分析的SDS-PAGE。箭头表示鉴定出的蛋白质。M：protein marker。 B. 与lncRNA结合的蛋白质Western Blot分析。 C. 检测PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中与lncRNA结合的蛋白质稳定性。 D. GCSC中EEF1A1和LRPPRC的mRNA和蛋白质水平。 E. 通过RT-qPCR和Western Blot分析验证GCSC中EEF1A1或LRPPRC的沉默。 F. EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的细胞活力。 G. EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的细胞周期分析。 H. EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的Caspase-3/7检测。 I. Western blot分析EEF1A1或LRPPRC沉默GCSCs的干性基因。**p<0.01  

（7）lncRNAs m6A修饰对GCSCs体内肿瘤发生的影响

图7：lncRNA的m6A修饰对体内GCSC肿瘤发生的影响。 A. 具有lncRNA甲基化GCSC的模型小鼠示意图。 B. 单独注射METTL3沉默的GCSC（对照）或用甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG注射METTL3沉默的GCSC的异种移植小鼠肿瘤体积。 C. 单独使用METTL3沉默的GCSC（对照）或甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的METTL3沉默的GCSC的小鼠实体瘤大小。 D. 单独使用METTL3沉默的GCSC（对照）或METTL3沉默的GCSC与甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的小鼠实体瘤重量。 E. 单独注射METTL3沉默的GCSC（对照）或METTL3沉默的GCSC与甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的小鼠实体瘤lncRNA m6A水平。 F. 免疫组化分析Ki67和Caspase 3在单独注射METTL3沉默GCSC（对照）或METTL3沉默的GCSC与甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的小鼠实体瘤表达。 G. western blot分析经甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG处理的小鼠实体瘤中干性基因表达。 H. 甲基化PSMA3-AS1和MIR22HG在GCSC中的作用模型。**p<0.01

研究小结：

本研究结果表明，由METTL3和METTL14介导的PSMA3-AS1和MIR22HG甲基化水平在GCSC中显著增加。研究揭示了PSMA3-AS1和MIR22HG的位点特异性m6A修饰抑制了细胞凋亡并促进GCSC干性。LncRNA甲基化增加了PSMA3-AS1和MIR22HG的稳定性，通过PSMA3-AS1–miR-411-3p–AP1G1或MIR22HG–miR-24-3p–SERTAD1轴促进GCSC增殖并抑制其凋亡。同时PSMA3-AS1或MIR22HG甲基化促进了PSMA3-AS1与EEF1A1蛋白或MIR22HG与LRPPRC之间的互作并稳定互作蛋白，从而抑制细胞凋亡并促进了GCSCs增殖。

参考文献：

CiY, Zhang Y, Zhang X. Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancerstem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis. Cell Mol Biol Lett. 2024 Apr 10;29(1):51.pii: 10.1186/s11658-024-00568-8. doi: 10.1186/s11658-024-00568-8. PubMed PMID:38600465.