又到了单细胞空间联合分析的时间了，今天我们参考的文献在Recurrence of cancer cell states across diverse tumors and their interactions with the microenvironment，单细胞空间对于肿瘤极其微环境的研究还是主流啊~~~
ABSTRACT
虽然遗传肿瘤异质性早已被认识到，但最近的工作揭示了癌细胞在表观遗传和转录水平上的显着差异。在单个癌症类型的单细胞水平上对肿瘤进行分析表明，转录异质性被表征成癌细胞状态，这意味着不同的细胞状态可能代表稳定和功能单元，在肿瘤维持和进展中具有互补作用。然而，目前尚不清楚这些状态在多大程度上跨越了肿瘤类型，构成了癌症的一般特征。此外，癌细胞状态在肿瘤进展中的作用及其与肿瘤微环境细胞的特定相互作用仍有待阐明。在这里，对 15 种癌症类型进行了泛癌单细胞 RNA-Seq 分析，并确定了 16 个基因模块的目录，这些模块的表达定义了复发性癌细胞状态，包括"stress”、‘interferon response’, ‘epithelial-mesenchymal transition’, ‘metal response’, ‘basal’ and ‘ciliated’。使用小鼠模型，发现干扰素反应模块的诱导因肿瘤位置而异，并在淋巴细胞消除后减弱。此外，空间转录组学分析进一步将癌细胞中的干扰素反应与肿瘤微环境中的 T 细胞和巨噬细胞联系起来。
Introduction
Transcriptional heterogeneity in cancer is increasingly recognized as a driver of tumor progression,metastasis and treatment failure(癌症中的转录异质性越来越被认为是肿瘤进展、转移和治疗失败的驱动因素). Single-cell RNA-Sequencing (scRNA-Seq) has enabled the unbiased transcriptomic profiling of individual tumor cells and has revealed a striking amount of heterogeneity among malignant cells of the same tumor(单细胞确实是表征肿瘤最好的研究手段). Furthermore, evidence has emerged suggesting that transcriptional heterogeneity is organized into modules of co-expressed genes（肿瘤基因模块）. Data from glioblastoma, oligodendroglioma, astrocytoma, head and neck cancer and melanoma among others, indicates that, within a tumor, cancer cells are heterogeneous in their degree of differentiation,ranging from stem- or progenitor-like to fully differentiated（在肿瘤内，癌细胞的分化程度是异质的，从干细胞样或祖细胞样到完全分化）. These studies performed in a variety of cancer types have also shown the existence of cancer cell states related to stress response, interferon response, and hypoxia. While certain states have been found in multiple studies, a general catalog of cell states across cancer types remains to be established. Such a coherent framework - if it exists - would allow us to search for common themes across cancer types and to understand how tumors are organized independently of their origin.
Beyond malignant cells, tumors are composed of a complex microenvironment including immune and stromal cells, which also play critical roles in tumorigenesis（除了恶性细胞，肿瘤由复杂的微环境组成，包括免疫细胞和基质细胞，它们在肿瘤发生中也起着关键作用）. In particular, the clinical success of immunotherapy across multiple cancers hints at commonalities in the interactions between cancer cells and the tumor microenvironment (TME). Causative links have been drawn between specific elements of the TME and cancer cell states. In one study of head and neck cancer, a population of partial epithelial-mesenchymal transition (pEMT) cancer cells at the leading edge of tumors was shown to interact with cancer-associated fibroblasts and mediate invasion. In glioblastoma and triple-negative breast cancer, factors of the TME appear to induce malignant cells to adopt a stem-like state. These works point to a need for a systematic analysis of cancer cell states, with a particular focus on the relation to the non-malignant cell types of the TME（这些工作表明需要对癌细胞状态进行系统分析，特别关注与 TME 的非恶性细胞类型的关系 ）.
Here, we characterize recurrent cancer cell states and their relationship with the TME by systematically assaying 15 cancer types to identify a catalog of recurrent cancer cell states using a gene-centric approach（肿瘤划类）. Analyzing scRNA-Seq data from previously published data as well as newly collected tumors, we identified 16 coherent gene modules and quantified their expression in malignant cells of each sample（模块表征肿瘤细胞）. This catalog includes modules present in all studied tumors, as well as others that are specific to particular sets of cancer types（该目录包括存在于所有研究肿瘤中的模块，以及特定于特定癌症类型集的其他模块）. To further study the cancer cells states, we used experimental models to perturb the tumor microenvironment and test for differential effects on the cancer cell states（扰乱肿瘤微环境并测试对癌细胞状态的不同影响）.While some of the states are related to known aspects of cancer biology, we present evidence that these processes are heterogeneously deployed by cells of the same tumor, and that this heterogeneity recurs across a wide range of cancer types. A detailed analysis of the interferon response module further led us to study its dependencies in vivo in the context of TME perturbations and to establish its proximity to macrophages and T cells across cancer types. Overall, the catalog of cancer cell states is a coherent representation of the makeup of a tumor, and provides a framework for the analysis and testing of the features of tumorigenesis（为分析和测试肿瘤发生的特征提供框架）。
Result
Recurring gene modules across diverse cancer types
在手术后立即收集了 19 个未经治疗的新鲜原发患者肿瘤，涵盖 9 种癌症类型。分离每个肿瘤以获得单细胞悬液，并在没有事先分选的情况下处理 scRNA-Seq，以确保对肿瘤细胞组成的公正评估。肿瘤收集包括 9 种癌症类型：卵巢癌 (OVCA)、子宫内膜癌 (UCEC)、乳腺癌 (BRCA)、前列腺癌 (PRAD)、肾癌 (KIRC)、肝癌 (LIHC)、结肠癌 (COAD) 和胰腺癌 (PDAC) ，以及一种非上皮癌类型，胃肠道间质瘤 (GIST)。首先通过使用标记基因、singleR 注释和推断的拷贝数变异的组合分析转录组，并控制双细胞的可能性来识别数据集中的恶性细胞。在样本中，注释了 9,036 个恶性细胞和 18,546 个非恶性细胞。为了扩展数据集，还在先前发表的肿瘤中进行了这种分析，包括额外的 PDAC 和 LIHC，以及额外的肿瘤类型：胆管癌 (CHCA)、肺腺癌 (LUAD)、头颈部鳞状细胞癌 (HNSC)、皮肤鳞状细胞癌 (SKSC)、多形性胶质母细胞瘤 (GBM)7 和少突胶质细胞瘤 (OGD)，共产生来自 62 个未经治疗的原发肿瘤的 19,942 个恶性细胞，涵盖 15 种癌症类型。
定义细胞状态的方法首先涉及对底层基因模块进行划类，随后最近的工作已将基因模块确定为细胞状态的定义特征（这个状态的定义类似于hallmark）。这是一种灵活的方法，因为它允许细胞表达模块的组合，从而允许细胞状态的复杂性。使用非负矩阵分解 (NMF，又是NMF，运用的太多了) 分析了恶性细胞，以将基因模块识别为一组共表达的基因。我们的方法检测样本中共表达的基因组，即在细胞亚群中一致表达的基因组。为了在肿瘤中寻找重复出现的基因模块，比较了已识别模块的基因组成。通过在基因模块而不是表达矩阵的水平上进行整合，样本和研究之间的技术变化的影响是有限的。尽管在各种癌症类型中独立鉴定了这些模块——因此不假设复发——发现在不同肿瘤中获得的模块显着重叠。重要的是，这种重复而不是唯一性的发现也不是批次效应的结果。
基因模块的重复能够构建 16 个共有模块的目录，每个模块的中位数为 37 个基因。为了确定模块是否显着存在于每个肿瘤的癌细胞群中，使用了基因集过度分散度量。一些模块丰富了特定的器官系统（如大脑或妇科器官），而其他模块则涵盖了多个器官系统和组织学。还在代表来自输卵管、乳房和肝脏的正常上皮的独立数据集中测试了模块的过度分散，以询问模块是否反映了在正常组织中发现的异质性的重建。对于大多数模块，发现正常上皮样本中的过度分散较低，这表明它们在正常组织中的表达差异不大。然而，模块目录确实在一定程度上在正常组织中检测到的事实表明，这些模块不是特定于癌症的，而是从现有模块中选择出来的，并且表达更加异质。还研究了模块的基因组成和癌症类型特异性，将与细胞过程相关的模块与与细胞身份相关的模块区分开来。
正如预期的那样，恢复了一个由细胞周期基因（例如 TOP2A、PCNA）组成的高重复性模块，捕获采样时循环的任何肿瘤中的癌细胞亚群。 另一个在肿瘤类型中反复出现的过程是应激反应（例如，JUN、FOS、HSPA1B），此前已对其进行了描述并证明其在黑色素瘤的耐药性中起作用。 还在下面提供了空间转录组学数据，这些数据为在没有解离的情况下癌细胞中这种状态的体内存在提供了额外的支持。
已在转移性卵巢癌中发现的干扰素反应模块广泛存在，表明恶性细胞中的干扰素反应在一系列实体瘤类型中是异质的。除了干扰素刺激的基因，如 STAT1 和 IFIT1，该模块还包含抗原呈递的成分，干扰素的一种充分表征的作用，包括 MHC I 基因，如 HLA-A 和 MHC II 基因，包括 HLA-DRA。虽然 MHC II 表达通常与专职抗原呈递细胞相关，但该途径也已显示在正常上皮细胞和癌细胞中表达。干扰素反应通常起到募集和激活免疫细胞的防御反应的作用，并已在癌症中得到广泛研究。在这种情况下，干扰素配体可能由癌细胞和树突状细胞 (DC)（对于 I 型干扰素、IFNα 和 IFNβ）或自然杀伤 (NK) 和 T 细胞（对于 IFNγ）分泌。或者，干扰素反应可以是癌细胞内在的，即独立于其他细胞类型的信号而激活；事实上，最近一项比较体外癌细胞系基因模块的研究也确定了一个干扰素反应模块，支持了 TME 独立反应的可能性。
在一系列癌症类型中还发现了两个与代谢过程相关的模块：缺氧模块（例如，VEGF、ADM）和氧化磷酸化模块（例如，ATP5H、LAMTOR2）。 实体瘤中对缺氧的代谢适应，伴随着糖酵解增加和血管生成的诱导，与癌症进展、耐药性、侵袭和转移有关。 尽管如此，最近的研究表明氧化磷酸化在几种癌症类型中起作用，这表明癌细胞可能依靠糖酵解和氧化磷酸化来产生能量。 金属硫蛋白基因的另一个基因模块——在此称为金属反应模块——可能在几种癌症类型的增殖和耐药性中起作用。
另一组模块对应于细胞身份，似乎与组织和细胞起源有关。所分析的大多数肿瘤是上皮起源的，因此确定了与已知上皮细胞类型标记重叠的模块：肺泡模块（例如，AGER、CAV1），它特别存在于 LUAD59-61 中，以及基底（例如，KRT5 和 KRT15）、鳞状（例如，KLK10、LY6D）和腺（例如，CLU、MUC5B）细胞模块。由纤毛相关基因（例如 FOXJ1、PIFO）组成的模块存在于妇科肿瘤以及 LUAD 和 GBM 中。在卵巢和子宫内膜肿瘤中，该模块仅存在于子宫内膜样样本（OVCA NYU2-3、UCEC NYU2-3）中，而不存在于高级别浆液性样本（OVCA NYU1、UCEC NYU1）中，表明纤毛形成是一个特征子宫内膜样组织学。该模块在正常输卵管和肺上皮组织中的存在表明其在癌症中的差异表达反映了起源组织的异质性。在肿瘤内观察到的分化模块的异质表达可以从临床病理学的角度提供对肿瘤结构的更详细的理解，其中评估每个肿瘤的等级和组织学亚型。
跨越多种癌症类型的两个模块与上皮间充质转化 (EMT) 相关：完整间充质模块 (cEMT)（例如 COL1A1、FN1）和部分间充质模块 (pEMT)（例如 LAMC2、VIM）缺乏典型的间充质标志物，如胶原基因。 pEMT 模块最近在 HNSC10 和 SKSC31 中得到表征，但也在 GBM7 中发现，这表明来自不同谱系的细胞在癌症中趋同于这种特性。 在少数样本中检测到 cEMT 模块的存在，但包括一系列癌症类型：主要是 PDAC、CHCA、LUAD 和 GBM。 最近的一项研究表明，pEMT 和 cEMT 可以发生在一系列癌症类型中，并且可能代表了两种途径，它们融合了间充质分化所赋予的表型特性，包括迁移和耐药性。 使用 TCGA 数据，确实发现 pEMT 基因模块的表达与无进展生存期降低有关。
最后，确定了三个神经癌症特异性模块：星形胶质细胞 (AC) 样（例如 APOE、ALDOC）、少突胶质祖细胞 (OPC) 样（例如 OLIG1、OLIG2）和神经祖细胞 (NPC) 样（例如 DLX1 , DLX5) 模块。
这些模块在一系列癌症类型中的广泛发生突出了分化程序的重新部署以及癌症和正常组织中不同的表达水平。 此外，虽然已鉴定的许多基因与癌症生物学的各个方面有关，但单细胞方法使我们能够证明它们在肿瘤的恶性细胞中异质表达，并且通常在恶性上皮细胞中表达水平高于正常上皮细胞。
为了测试是否也可以使用独立的方法检测 16 个模块的类别，使用了 SCENIC，这是一种识别表达相关且受相同转录因子调节的基因的方法。 发现我们目录中的每个模块都与几个 SCENIC 调节子有显着的重叠。 例如，干扰素反应模块与几个用转录因子 STAT1 和 IRF1 注释的 SCENIC 调节子重叠。
Defining cancer cell states by gene module expression
Having established the catalog of cancer gene modules, we next sought to understand how they are generally assembled at the level of individual cells（接下来试图了解它们通常是如何在单个细胞水平上组装的）. In particular, we asked whether cells are constrained in which modules or combinations of modules they can express. For this, we scored each malignant cell for the expression of each of the modules. In the SKSC Ji1 sample, for example,expression of basal, squamous and cycling modules was mutually exclusive, but each of these had co-expression with the stress or pEMT module. More generally, we found that most cells express a combination of modules, though not all combinations are possible. These results support the notion that, in defining a cancer cell state, it is crucial to examine the complete set of gene modules expressed（检查表达的完整基因模块集至关重要）。
由于模块在癌症类型中反复出现，推断细胞模块评分可以作为比较不同患者癌细胞的自然轴。最值得注意的是，该空间中的癌细胞不按患者或癌症类型分组，而是按其表达最高的模块分组。这与以下发现形成鲜明对比：在基因表达空间中，癌细胞按患者聚集，并在去除个别基因引起的变异时突出癌症类型的共性。如 SKSC Ji1 所述，某些模块之间存在一定程度的共表达：例如，pEMT 与压力和干扰素反应共表达。连同细胞不形成不同簇的事实，这支持了癌细胞状态通常不代表离散实体的观点。然而，我们确实观察到了与表达周期或纤毛模块的细胞相对应的离散cluster。在基于基因表达的降维中单独检查肿瘤时，也会识别这些cluster，因此不是模块得分降维的伪影。
由于某些模块也存在于非癌症样本中，我们query表达每个模块的细胞比例是否在恶性和非恶性上皮之间有所不同。 为此，将恶性细胞中的模块表达频率与匹配样本中的非恶性细胞中的模块表达频率进行了比较。 而对于 LUAD、SKSC 和 THCA，我们与配对的相邻正常样本的上皮细胞进行了比较，而在 PDAC 中，来自相同样本的非恶性导管细胞用作配对的正常比较。
相对于正常，pEMT 模块在所有三种癌症类型中的表达频率更高，这与 EMT 在上皮癌中的常见发生率一致。 相对于正常，干扰素反应模块在 LUAD 和 SKSC 中的表达频率增加，但在 PDAC 中没有变化。 这可能部分解释为用作参考的导管细胞是肿瘤本身的一部分，并暴露于 TME。
正常肺和皮肤具有鳞状成分，一致观察到肿瘤样品中鳞状表达没有差异。相比之下，相对于正常导管细胞，在 PDAC 中诱导了鳞状模块，表明恶性细胞群中的鳞状分化。对于基础模块观察到类似的趋势。基于bulk转录组学提出了几种 PDAC 分类，包括经典亚型（腺体基因的高表达，包括 TFF1 和 CEACAM6）和基底亚型（鳞状和基底基因的高表达，包括 LY6D 和 KRT15）之间的区别。尽管鳞状细胞胰腺癌很少见，但 PDAC 中鳞状细胞表达频率的增加表明部分化生向鳞状细胞程序转变是常见的。 LUAD 和 PDAC 中腺体模块的表达相对于它们的正常对应物没有变化，但相对于正常皮肤在 SKSC 中增加。这种模式表明，恶性细胞群保留与其细胞来源类型相关的模块表达（例如，保留 SKSC 中的鳞状模块），并进一步部署来自其他细胞类型的基因模块（增加 SKSC 中腺模块的表达）。
Expression of the interferon response is modulated by the tumor microenvironment
癌细胞状态可能反映了常见的物理限制以及与其微环境中细胞成分的相互作用。值得注意的是，免疫疗法在一系列癌症类型中的成功表明癌细胞和免疫细胞之间存在保守的相互作用，这让我们质疑与免疫系统的相互作用是否会影响发生的癌细胞状态。干扰素反应模块尤其可能参与癌细胞和 TME 之间的相互作用。在肿瘤中，I 型干扰素由癌细胞和 DC 分泌，以响应 DNA 片段激活 cGAS/STING 通路，并导致 T 细胞启动和抗肿瘤活性。 IFNγ 主要由适应性免疫细胞在激活时产生，并导致 MHC I 基因的上调，最初促进肿瘤排斥，但最终通过免疫编辑导致 IFN 无反应的肿瘤。根据这些观察，我们query是否需要适应性免疫细胞来在体内引发癌细胞中的干扰素反应模块。为此，使用了已建立的同种异体移植小鼠癌症模型，其中 TME 很容易受到干扰。对四个原位胰腺肿瘤进行了 scRNA-Seq，以验证基因模块可以在原位模型中重现。像之前一样使用 NMF 识别基因模块，发现在这个系统中有五个被概括：循环、应激反应、干扰素反应、缺氧和腺体分化。
同时，从 Rag1-/- 小鼠中形成的四种原位肿瘤中收集了 scRNA-Seq 数据，这些肿瘤缺乏 T 和 B 细胞。分析来自这些肿瘤的恶性细胞中的基因模块表达，发现循环、应激反应、缺氧和腺体分化在 Rag1-/- 和 WT 小鼠之间以相似的频率表达。相比之下，干扰素反应模块在来自 Rag1-/- 小鼠的肿瘤中以较低频率表达（p < 10-10，Kolmogorov-Smirnov 检验）。此外，相对于其他癌细胞，干扰素反应模块的所有基因在表达干扰素反应的细胞中都被上调，这表明协调反应得以维持——尽管细胞较少。干扰素反应模块的 MHC I 基因（B2m、H2-D1、H2-K1）在 Rag1-/- 小鼠中总体表达较低（尽管它们在干扰素反应表达细胞中保持相对上调），表明淋巴细胞耗竭对 MHC I 基因的表达具有额外的一般影响，该基因不依赖于干扰素反应.
接下来测试了不同的肿瘤微环境是否也会调节干扰素反应模块的表达。 在一项实验中，将胰腺中的原位肿瘤（癌症的起源部位）与腹膜中的异位肿瘤（常见的转移部位）进行了比较。 发现腹膜中的肿瘤具有较低频率的干扰素反应表达细胞（在 Kolmogorov-Smirnov 检验中 p < 10-6）。 在第二个实验中，比较了两个异位部位（腹膜和肝脏）的频率，以模拟体内不同的转移部位。 在这里，发现干扰素反应模块在肝脏中的表达频率高于腹膜（p < 10-10，Kolmogorov-Smirnov 检验）。
总的来说，这组实验提供了对干扰素反应模块在癌症中出现的初步评估。 该模块在各种癌症类型、器官和免疫环境中的存在表明，恶性细胞间干扰素反应的异质性是肿瘤的一个共同特征。 发现适应性免疫系统对于该模块的大部分（但不是全部）表达是必要的。 淋巴细胞耗尽状态下的剩余表达表明癌细胞中干扰素反应的其他原因，无论是癌症外源性，例如 NK 细胞分泌的干扰素，还是癌症内源性，与体外干扰素反应模块的报告一致。 值得注意的是，这一发现并没有区分引发干扰素反应的信号机制和导致选择肿瘤内状态的长期免疫编辑.
Spatial organization of malignant and non-malignant cell types in the tumor
为了进一步分析癌细胞状态与 TME 细胞之间的组织和相互作用，我们转向基于测序的空间转录组学 (ST)。 与解离后获得的 scRNA-Seq 不同——导致任何空间信息的丢失——基于阵列的 ST 数据不是以单细胞分辨率捕获组织内每个位置的 mRNA，而是每个点捕获约 10 个细胞。 因此，试图通过整合十个肿瘤（OVCA NYU1、OVCA NYU3、UCEC NYU3、BRCA NYU0、BRCA NYU1、BRCA NYU2、PDAC NYU1、GIST NYU1、GIST NYU2、LIHC NYU1）的配对数据来利用这两种模式的特性。 我们的 10 个肿瘤 ST 数据集中的每一个都由 6mm x 6mm 区域上的约 2,000 个点（范围从 1,351 到 2,624）组成。 ST 阵列上的斑点相隔 100μm，使我们能够深入了解肿瘤微环境，例如，在这种距离下，旁分泌信号传导功能。
由于每个点都是一种或多种细胞类型的细胞组合，因此其转录组可以表示为细胞类型转录组的加权总和。 为了推断每个细胞类型在每个点的贡献，使用来自配对单细胞数据的细胞类型的平均表达谱进行了非负线性最小二乘 (NNLS) 回归（单细胞空间联合）。 然后，将针对每种细胞类型获得的系数与在随机模型中获得的系数进行比较，如果某个细胞的系数比随机集中的平均值高出两个以上的标准差，则认为该细胞存在于某个点。 团队的病理学家（C.H. 和 D.F.D.）进一步验证了这些注释。 作为进一步分析的框架，我们根据细胞类型注释将斑点分为三类：“恶性”，仅包含恶性细胞，“正常”，仅包含免疫和基质细胞，以及“两者”，包含组合。
作为spot分类的独立方法，还直接比较了 10 个配对数据集的spot和单细胞转录组。&&下图 b 显示了来自 OVCA NYU1 样本的转录组的降维图，灰色点表示 ST 点，其他颜色表示单细胞转录组，由注释的细胞类型着色。通过调用相互最近邻 (MNN) 集成和联合降维，发现来自两种模态的数据很好地集成在一起。单个细胞在外围形成cluster，表明不同的细胞类型。 ST 点要么与单个单细胞cluster混合，表示纯种群，要么连接多个cluster，表示细胞类型的组合。将 NNLS 方法确定的spot类别叠加到该图上，始终观察到“恶性”斑点与恶性细胞cluster混合，“正常”spot位于非恶性细胞类型区域，“两个”斑点跨越恶性和非恶性单细胞cluster。作为第二个例子，LIHC ST 数据集显示了两个空间不同的肿瘤结节，左侧有大量恶性和非恶性细胞混合，右侧几乎仅由恶性细胞组成。联合降维分析反映了两个对应的恶性cluster，在单独考虑单细胞降维时没有区别。该分析强调了整合成对的空间和单细胞数据集以将单个细胞锚定在其空间环境中的潜力。
为了进一步测试 NNLS 方法注释斑点的准确性，对两个源自患者的黑色素瘤异种移植物 (PDX) 进行了配对的 scRNA-Seq 和 ST。 在这种情况下，只有恶性细胞来自人类，因此表达人类基因，使我们能够可靠地识别恶性细胞或斑点。 在完整的小鼠和人类转录组上使用 NNLS 方法，我们首先为点身份建立了“基本事实”。 然后我们通过将小鼠基因转换为人类直向同源物来模拟患者样本，从而去除物种信息。 以这种方式使用 NNLS 注释斑点导致每个样本的特异性分别为 99% 和 89%，支持其准确性。
Cancer cell state analysis of tumor cellular neighborhoods（空间临近分析）
确定了每个肿瘤内的恶性和非恶性细胞类型后，接下来试图根据癌细胞状态query细胞邻域的组成。为此，绘制了每个 ST 样本中的癌细胞状态，对每个“恶性”点的每个模块的表达进行评分。为了确定这种评分方法的有效性，首先再次转向 PDX 数据并对模块表达的“恶性”点进行评分。由于在该系统中可以明确地区分人类恶性细胞与小鼠 TME 细胞，我们首先使用单细胞数据来确认模块是由恶性细胞本身差异表达的，并排除了由 TME 污染引起的伪影的可能性。例如，pEMT 模块包括通常由成纤维细胞表达的基因，但我们在恶性细胞中检测到它的存在。正如预期的那样，干扰素反应模块不存在，因为与 Rag-/- 小鼠一样，这些小鼠缺乏淋巴细胞。
为了表征每个“恶性”点周围的细胞类型组成，计算了每种细胞类型的两个分数指数，旨在捕捉它们的微环境。 将“邻域分数”定义为包含该细胞类型的周围斑点的分数。 因此，该分数直接测量相邻点中的细胞类型组成。 邻近度得分衡量感兴趣点与每种细胞类型的接近程度，并计算为到该类型细胞的最短距离的倒数。
将每个肿瘤“恶性”点的模块评分和细胞类型邻域特征相关联，揭示了 TME 的癌细胞状态和细胞类型如何共同定位以形成“邻域”。更密切地研究这种相关性证实了模块评分和巨噬细胞邻域评分之间这种正相关关系的重要性。在使用接近度评分计算巨噬细胞的存在时，也观察到了一致的关系。为了探索所有样本之间的这种关系，我们计算了巨噬细胞邻域的相关分数（±log10（p 值））。与干扰素反应的相关性在所有样品中均呈正相关，10 个样品中有 8 个显着。任何其他模块都不是这种情况。这表明巨噬细胞可能会引发干扰素反应模块的表达，或者表达干扰素反应的癌细胞可能会募集巨噬细胞。事实上，最近的一项研究表明，刺激肿瘤中的干扰素反应途径会导致巨噬细胞的募集和激活。
使用邻域和邻近度量扩展对所有细胞类型和模块对的分析，确定了细胞状态与 TME 细胞类型的其他一致共定位。 除了巨噬细胞外，根据这两种方法，表达干扰素反应的癌细胞与 T 细胞共定位，这与淋巴细胞导致干扰素反应增加的体内发现一致。 需要进一步的工作来确定这些相互作用的模式和方向。 进行EMT的癌细胞与成纤维细胞和内皮细胞呈正相关，与其他恶性细胞呈负相关，与在肿瘤界面富集并与癌相关成纤维细胞相互作用的发现一致。
Methods（关注一下重点方法）
Cell type annotation and detection of malignant cells
Non-negative matrix factorization (NMF) and module detection
Graph-based clustering and identification of consensus gene modules
SCENIC module identification and module comparison
Module expression scoring
Deconvolution of spatial transcriptomic spots.
Annotation of spatial transcriptomic spots
生活很好，有你更好
