工作已经进入了正轨，10X单细胞空间似乎永远在路上，但是慢慢研究的风向开始起了变化，单细胞空间都不再满足于对组织的研究，而是要靠向临床，运用单细胞空间技术对临床进行指导，今天分享的文献在Tumor and immune reprogramming during immunotherapy in advanced renal cell carcinoma，发表于Cancer Cell,IF32分，单细胞的研究开始结合临床数据等等，看起来，每个技术不能停留在实验室，而是要走向应用。
总结一下小知识
TOX 和 ENTPD1（编码 CD39）是两种在肿瘤特异性 T 细胞中上调的耗竭标志物
单核细胞，目前最新的研究结果认为，单核细胞有两种分化途径，分别是CMP→粒细胞-单核细胞前体（Granulocyte-monocyte progenitor，GMP）→单核细胞，以及CMP→单核-树突状细胞前体（Monocyte-Dendritic cell progenitor，MDP）→单核细胞。单核细胞可以继续分化为部分组织中的巨噬细胞，例如肠道和真皮等。但最新的研究显示，大多数组织如大脑（microglial cell，小胶质细胞）、表皮（langerhans cell，朗格汉斯细胞）、肝脏（kuffer cell，枯氏细胞）和肺泡中的巨噬细胞并非依靠后期的单核细胞分化更新，而是由胚胎造血系统直接原位分化，在胚胎发育阶段就已经定植到组织中，并且在组织中自我更新和维持。单核细胞能吞噬异物并进行抗原递呈，可以被看作不成熟的巨噬细胞，因此有些研究者直接将单核细胞称为巨噬细胞，或者将单核细胞和巨噬细胞统一称为Monocytes/Macrophage类群。根据细胞表面的一组蛋白质，单核细胞可以分为三类：经典（Classical）、非经典（Non-classical）和中间型（Intermediate），它们在免疫系统中起着不同的作用。典型单核细胞占单核细胞的80%~90%，具有更高水平的吞噬和抗菌活性，并且表现出较高的过氧化物酶活性，在产生活性氧（ROS）方面更有效。它们还具有更高水平的趋化因子受体，能够迁移到损伤和炎症部位；非经典单核细胞的功能偏向于调节和监视，这些细胞吞噬作用、ROS和促炎因子的水平较低，主要在伤口或感染部位招募其他细胞，促进伤口愈合并应对病毒感染等，也有一些研究表明，非经典单核细胞同样直接参与免疫调节；中间型单核细胞，其功能处于中间状态，具有炎症特性，但同时具有较低的过氧化物酶活性。
一般来说，单核细胞的固有标志物是CD14，人可以用CD16来区分不同亚型：经典型单核细胞标记为CD14+CD16-；中间型单核细胞标记为CD14+CD16+；非经典型单核细胞标记为CD14+CD16++。小鼠可以用Ly6C来区分，经典单核标记为CD14+Ly6C++；中间型为CD14+Ly6C+；非经典为CD14+Ly6C low。同时，还可以利用炎症因子和趋化因子受体来进行区分，包括CCR5、CX3CR1、CD62L等。此外，由于巨噬细胞同样表达这些marker，如果要区分单核细胞和巨噬细胞，则需要添加巨噬细胞的标志物，例如人的CD80、小鼠的F4/80等。
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巨噬细胞作为固有免疫中的重要细胞组分，能对入侵病原体做出反应，吞噬和消化病原体，也可以参与清除受损、衰老的细胞，通过抗原提呈参与激发适应性免疫。但是巨噬细胞除了在对抗疾病中发挥作用外，也与慢性疾病（包括动脉粥样硬化、哮喘、炎症性肠病、关节炎等）、自身免疫性疾病（包括类风湿性关节炎、多发性硬化症）、糖尿病、肿瘤的发生发展相关。巨噬细胞根据其所处部位，可以将巨噬细胞分为小胶质细胞、肝脏Kupffer细胞、肺泡巨噬细胞、肾脏系膜细胞、破骨细胞、脾脏红髓巨噬细胞、脂肪组织相关巨噬细胞等。它们除了执行吞噬和免疫防疫功能外，也参与组织重塑和维持组织稳态。此外，它们可能在不同的组织中执行特定的功能，例如小胶质细胞在脑组织中发挥免疫监视、清除死亡神经元、突触重塑的功能，破骨细胞从骨基质中吸收有机物和矿物质，脾脏中的红髓巨噬细胞能清除衰老的红细胞、调节铁代谢等。各部位的特征marker详见表1。
图片.png 相较于按组织进行分类，研究者们更喜欢把巨噬细胞按特征和功能进行区分。根据活化状态、功能及分泌细胞因子的不同，巨噬细胞主要可分为经典活化的M1型巨噬细胞（促炎）和选择性活化的M2 型巨噬细胞（抗炎）。
- M1型巨噬细胞可以由IFN-γ、LPS或GM-CSF诱导，高表达MHC II类分子和共刺激分子CD80、CD86，上调表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），产生大量的促炎细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α，同时会产生趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL16，一氧化氮（NO）和活性氧物质（ROS）。通过释放这些炎性介质，M1细胞可以促进炎症反应，杀伤胞内感染的病原体，抗肿瘤。
- M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13、真菌和寄生虫感染、免疫复合物、IL-10、TGF-β、糖皮质激素等诱导，高表达CD163、CD206、CD200R、CD209、CD301、Arginase-1，产生抗炎细胞因子如IL-10、TGF-β，参与免疫调节、组织重构和再生、伤口愈合、血管生成、促进肿瘤进展。M2型巨噬细胞可进一步细分为M2a、M2b、M2c、M2d四种亚型。M2a由IL-4、IL-13或真菌和寄生虫感染诱导，M2b由免疫复合物和LPS诱导，M2c由IL-10、TGF-β、糖皮质激素诱导，M2d可由IL-6和腺苷诱导。
- 除了M1和M2以外，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）也是非常常见的研究类型。但是严格来说，TAM并非巨噬细胞中的一个子类，而是与特定病理情况相关的巨噬细胞的集合。依据不同的病理状态，其活化状态和功能兼具M1和M2的特征。
- 除了上述几种子类之外，巨噬细胞还有 CD169+和 TCR+两种类型。CD169+巨噬细胞具有结合红细胞的能力。淋巴结包膜下窦和髓质区、脾边缘区中的巨噬细胞高表达CD169。到目前为止，CD169+巨噬细胞的信号传导途径和活化信息还不足，与M1、M2的对比也不甚清楚。TCR＋巨噬细胞会表达TCRγδ可变链，在细菌暴露后，会表达不同的TCRVδ库，表明这类细胞能针对不同细菌发生不同的适应性改变，且不仅仅是巨噬细胞，嗜酸性和嗜中性粒细胞同样被发现部分表达TCRαβ或TCRγδ可变链。
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为研究巨噬细胞，通常需要采用一些表型标记物来区分巨噬细胞和其他免疫细胞。小鼠巨噬细胞表达CD11b，F4/80，CSF-1R/CD115；人巨噬细胞表达CD68，CD11b，CD14，CD16，CD163，CD312，CSF-1R/CD115。一般来说，F4/80+ CD11c+ iNOS+定义为M1，F4/80+ CD206+定义为M2。但是巨噬细胞依然有待寻找更好的标志物，目前部分常见的标志物详见表2.
图片.png 巨噬细胞M1 associated genes（LI2B、TNF、CXCL9、CXCL10、CXCL11、FCGR1A、IRF1、HLA-DPB1、CD86、MARCO、IL2RA），M2 associated genes（CXCR4、IL27RA、CSF1R、CCL2、CCL7、CCL17、CCL18、CCL23、CTSD、FN1、GAS7、HMOX1、PPARG、LIPA、CD209、CLEC7A、F13A1、MAF、MS4A4A）.
In Brief
剖析免疫检查点阻断暴露的转移性肾细胞癌中的癌细胞和免疫微环境转录程序，揭示临床耐药背景下免疫亚群重编程和与不同癌细胞群的相互作用。
Highlights（创新点）
- Distinct CD8+ T cell phenotypes are enriched after immune checkpoint blockade (ICB)
- Immune checkpoint ligands are upregulated in macrophages and tumor cells after ICB（都是要结合临床）
- Two cancer cell subpopulations are conserved across heterogeneous RCC tumors（肿瘤的保守型）
- Cancer cell programs drive distinct immune interactions and predict patient outcomes（癌细胞在驱动不同的免疫相互作用）
SUMMARY
免疫检查点阻断 (ICB) 导致部分晚期肾细胞癌 (RCC) 患者的疾病得到持久控制，但驱动耐药的机制却知之甚少。在 ICB 治疗之前或之后描述了来自转移性 RCC 患者的癌症和免疫细胞的单细胞转录组。在响应细胞中，细胞毒性 T 细胞亚群表达更高水平的共抑制受体和效应分子。来自处理过的活组织检查的巨噬细胞响应富含干扰素的微环境而转变为促炎状态，但也会上调免疫抑制标志物。在癌细胞中，确定了 ICB 后在血管生成信号传导和免疫抑制程序上调方面不同的两个亚群。癌细胞亚群和免疫逃避的表达特征与 PBRM1 突变和原发性和 ICB 治疗的晚期 RCC 中的存活相关。研究结果表明，ICB 重塑了 RCC 微环境并改变了癌症和免疫细胞群之间的相互作用，这对于理解对 ICB 的反应和抗性至关重要。
INTRODUCTION
肿瘤微环境在肾细胞癌 (RCC) 的发生、病理生理学和治疗中起关键作用（各种癌症中都一样的）。 最常见的 RCC 组织学亚型，clear cell RCC (ccRCC)，在 VHL 所在的染色体 3p 缺失的背景下，经常在 VHL 中具有特征性的第二次打击功能丧失突变。 这些事件导致缺氧诱导因子 (HIF) 的降解减少，导致突变细胞转向使用糖酵解和分泌 VEGF，从而促进血管生成。 此外，ccRCC 肿瘤被免疫细胞高度浸润，特别是被 T 细胞浸润。 利用微环境的这些特征，治疗在过去十年中取得了显著进展，现在广泛使用 VEGF 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)、免疫检查点阻断 (ICB) 以及这些方法的组合。
ICB can provide durable benefit in responders,但大多数患者都会出现耐药性，并且对癌症和免疫细胞过程的因果关系知之甚少。 ICB 反应的基因组特征集中在bulk测序的预处理样本上，其中较低的基线骨髓炎症和 PBRM1 功能丧失与某些患者群体的反应有关。 对肿瘤内和肿瘤间异质性的观察使机制理解复杂化，ccRCC 的多种分子亚型由一组染色质重塑剂中的突变定义，这些突变表现出不同的进化和转移模式.
bulk测序不太适合研究细胞类型特异性对治疗的反应模式。 缺乏具有代表性的临床前免疫活性 RCC 模型对研究细胞类型之间的相互作用和信号传导提出了进一步的挑战。 为了应对这些挑战，最近的研究利用患者样本的单细胞分析来查明起源癌细胞并描述未经治疗的 RCC 中的免疫细胞。 因此，假设，在 ICB 治疗之前或之后对活检组织进行单细胞转录组解剖将揭示免疫和癌细胞计划，这些计划决定了治疗反应并指定了对抗耐药性的目标。
RESULTS
Characterizing the tumor microenvironment of advanced RCC during therapy
这里收集了 8 名患者的新鲜活检或手术切除样本，其中 7 名患有转移性肾细胞癌，1 名患有局部疾病。使用 10 X 平台对解离的细胞进行单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，并在可用的情况下使用额外的组织进行bulk全外显子组测序。活检时，5 名患者接触过 ICB（包括 4 名同时接触 TKI 和 ICB），3 名患者未接受全身治疗。在肾切除术的情况下，标本来自肾脏，否则来自淋巴结和内脏转移。七名患者患有 ccRCC，而一名肿瘤具有 2 型乳头状 RCC 组织学，具有 PBRM1 和 SETD2 突变。正如预期的那样，在可获得基因组特征的 ccRCC 患者中普遍检测到染色体 3p 丢失，在 VHL 和/或编码染色质重塑物的基因中存在额外的二次突变。概括地说，队列在基因组和临床特征方面概括了晚期 ccRCC 的典型特征。
经过QC后，数据集包括 34,326 个总细胞，涵盖各种癌症和非恶性细胞类型。 为了减轻可能的批次效应并允许对具有患者特异性表达模式的癌细胞进行联合分析，使用 Seurat 基于 CCA 的比对来聚合样本中的细胞，并以无监督的方式将它们联合聚类。基于标记基因标记聚类表达，识别在患者、活检部位和接受的全身治疗之间共享的癌症和非癌细胞clusters。
CD8+ T cell remodeling by ICB
队列中所有exposed于 ICB 的患者都接受了针对 PD-1 axis的治疗，因此假设治疗可能会导致淋巴compartment的细胞（亚）类型特异性重塑。 为了解决这个问题，首先在广泛的淋巴细胞类型中进行无监督聚类，以识别患者、活检部位和治疗历史中保守的细胞状态。 鉴定了 12 个淋巴细胞亚群，包括 B 细胞、浆细胞、自然杀伤 T 细胞、FGFBP2+ 和 FGFBP2- 自然杀伤细胞、调节性 T 细胞以及记忆和效应 T 辅助细胞。
CD8+ T 细胞形成了四个不同的细胞群，包括一个在细胞周期中progressing的细胞群、一个以干扰素刺激基因 MX1 表达为标志的小细胞群，以及两个通过表达包括 TNFRSF9（encoding the activation marker 4-1BB） 在内的一组基因而分化的细胞群。 共抑制受体 PDCD1（编码 PD-1）、HAVCR2（编码 TIM-3）和 LAG3 在所有 CD8+ T 细胞亚群中表达，但在更大比例的 4-1BB-Hi 细胞中检测到。 TOX 和 ENTPD1（编码 CD39）是两种在肿瘤特异性 T 细胞中上调的耗竭标志物，在 4-1BB-Hi 和循环细胞中也升高。 在与 ENTPD1 相反的模式中，观察到 IL7R 和 STAT4 在细胞亚群中的表达，这两个基因与 T 细胞寿命和记忆相关，在与黑色素瘤中 ICB 反应相关的细胞群中上调。
对黑色素瘤模型的研究表明，肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞包括一个祖细胞耗尽的population，该population长期存在，对抗 PD-1 治疗有反应，并最终分化为最终耗尽的细胞。 这种 CD8+ T 细胞群在治疗前活检中的频率预测了用 ICB 治疗的黑色素瘤的积极临床结果。 为了确定在 RCC 中恢复的任何 CD8+ T 细胞亚群是否类似于这种祖细胞耗尽的表型，对单个细胞的祖细胞和最终耗尽的基因特征进行了评分。 发现祖细胞耗尽的特征在 4-1BB-Lo clusters内的一个细胞子集中富集。 相反，在其他 CD8+ T 细胞群中，terminally exhausted的特征升高。
确定了 RCC 中的候选 CD8+ T 细胞亚群与之前描述的祖细胞衰竭群体有一些相似之处，接下来检查了基于 ICB exposure的表达差异。在 CD8+ T 细胞亚群中，发现 PDCD1、TIGIT 和 HAVCR2 在 ICB exposure的活检中仅在 4-1BB-Lo cluster内显著上调，这是由响应驱动的效应。在效应分子中，观察到 4-1BB-Lo 和 4-1BB-Hi population中 GZMB、PRF1 和 IFNG 的 ICB exposure活检组织中表达升高，但只有 4-1BB-Lo 细胞上调 GZMA 和 FASLG。同样，只有 4-1BB-Lo 细胞上调了许多共刺激分子和趋化因子。相反，来自 ICB exposure活组织检查的 4-1BB-Lo 细胞下调了与祖细胞衰竭表型相关的几个基因，暗示可能向更终末期衰竭状态分化。在黑色素瘤模型中，多功能祖细胞耗尽的 CD8+ T 细胞在响应抗 PD1 期间分化为更终末耗尽的表型，而后者population主要负责肿瘤杀伤，尽管寿命很短。在队列中接触 ICB 的患者的 4-1BB-Lo 细胞中，观察到与来自无反应者的细胞相比，来自反应者的细胞中最终耗尽的基因特征显著富集。
为了验证在未配对活检中观察到的这些现象，检查了接受抗 PD-1 抗体 nivolumab 单药治疗的更大队列患者 (Checkmate 009)，这些患者可以使用Longitudinal治疗前和治疗中bulk转录组。在这些配对活检中，观察到治疗样本中表达特征的水平显著增加，该表达特征源自比较来自我们单细胞队列的 ICB exposure与 ICB 幼稚 4-1BB-Lo 细胞。一致地，治疗样本表现出更高水平的共抑制（例如，PDCD1、LAG3）和效应分子（例如，IFNG、PRF1）。这些发现与 RCC 中可能存在的 4-1BB-Lo CD8+ T 细胞亚群一致，但并未明确证实，这些细胞亚群对抗 PD1 治疗的反应机制类似于在基于黑色素瘤和慢性病毒感染。Longitudinal单细胞研究对于明确检测个体患者中亚群特异性治疗相关分化是必要的。
Shift toward inflammation in tumor-associated macrophages
除了适应性免疫外，先天免疫系统在肿瘤存活和治疗抵抗中起着关键作用。 特别是，据报道，肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 在肿瘤微环境中发挥着多种相反的作用，其不同的表型促进炎症、肿瘤生长、血管生成和转移以及癌细胞杀伤。 在 ccRCC 中，TAM 是多种多样的，mass cytometry with worse识别出 17 种表型和高骨髓炎症，这与抗 PD-1 治疗的较差结果相关。 因此，试图描述队列中的骨髓细胞及其对治疗的反应。
这里提取了基于标记表达从完整数据集中识别出的骨髓细胞，并对它们进行亚聚类，识别出两个树突细胞clusters（CLEC9A+ 和 CD1c+ 经典树突细胞）、两个单核细胞clusters（经典 CD16- 和 CD16+ 单核细胞）和五个clusters TAMs 表达了多种免疫调节基因。这些细胞群的比例在患者之间和整个 ICB exposure状态下是稳定的。将巨噬细胞简单的 M1/M2 二分法分别分为促进炎症和伤口愈合/组织修复的表型，越来越多地被理解为不能完美地捕捉 TAM 表型的多样性，事实上，这里没有观察到 M1 和 M2 表达的干净二分发标记基因。一小部分 CXCL10-Hi TAM 特异性地表达了一组与经典 M1 激活表型相关的基因。然而，其他三个非循环 TAM ulations exp在不同程度上表达了不同的 M2 相关基因。在高表达 GPNMB 的 TAM populations中强有力地检测到了多个 M2 相关基因，此前有报道称其在急性肾损伤小鼠模型中促进 M2 极化。一个单独的 TAM 群具有 FOLR2 表达升高，典型地描述为标记 M2 巨噬细胞，expressed a distinct subset of M2-associated genes。最后一组 M1 和 M2 相关基因混合表达的 TAM 以 VSIR 的高表达为标志，VSIR 编码 VISTA，一种 PD-1 同源物，作为抑制 T 细胞活化的阴性检查点。
为了更好地了解这些不同的 TAM populations在 ICB 过程中所起的作用，分析检查了它们的免疫检查点基因和免疫相关转录程序的表达。 PD-L2 和（在较小程度上）PD-L1（两者都是 PD-1 信号传导介导 T 细胞免疫检查点的配体）在 TAM populations中很少检测到。 LGALS9、VSIG4 和 VSIR（其蛋白质产物通过其他途径促进 T 细胞免疫检查点）以及可抑制巨噬细胞炎症反应的 SIGLEC10 被更广泛地检测到。比较 ICB-exposed 患者有无反应，注意到表达模式发生了广泛而显著的变化，表明在所有 TAM 和单核细胞populations中响应干扰素信号转为 M1 样表型，CXCL10-Hi TAM 除外，它已经显示出 M1 极化的证据。同时，观察到与巨噬细胞活性相关的表达特征的系统性增加，包括抗原呈递和蛋白酶体功能。总的来说，这些模式表明 ICB 应答者的 TAM 广泛转变为促炎表型，这可能是由 CD8+ T 细胞产生的干扰素-g 诱导的。同时，还观察到 ICB-exposed 与幼稚 TAM 中 CD8+ T 细胞免疫检查点和巨噬细胞抗炎信号基因的系统性和显著上调。这种影响大部分是由来自 ICB 反应患者的 TAM 驱动的，与来自无反应者的细胞（所有 ICB 后评估）相比，其 VSIR、VSIG4、PD-L2 和 SIGLEC10 的表达水平进一步增加。因此，即使应答者中的 TAM 表现出更多的促炎表型，它们也表现出可能抑制炎症免疫微环境的表达变化，从而可能促进最终对 ICB 的抵抗。
Two distinct cancer cell subpopulations
为了更好地了解癌细胞中活跃的可能驱动与免疫系统相互作用的细胞程序，接下来试图确定癌细胞之间的共享表达模式。 通过基因表达和拷贝数改变将细胞分类为恶性细胞。 将来自不同活检的癌细胞组对齐，以关注整个队列中细胞程序的共享变异。 在活检中，细胞形成了两个主要clusters，分别称为肿瘤程序 1 (TP1) 和肿瘤程序 2 (TP2)，少数细胞以细胞周期进展为特征。 TP1 和 TP2 细胞均从所有样本中回收，除了一个癌细胞很少 (P912) 的样本，与活检部位或ICB exposure无关。
对来自两个主要cluster的细胞的各种基因特征的活性进行了评分，以识别它们转录差异背后的细胞程序。在不同的转移部位，TP1 细胞在肾脏形态发生、粘附连接组装和血管生成的基因组中得分较高。 TP2 细胞的特征在于代谢程序的巨大差异，糖酵解和氧化磷酸化增加，同时脂肪酸代谢增加。 TP2 细胞中氧化磷酸化和糖酵解基因的同时上调是出乎意料的，表明该肿瘤亚群的代谢升高，这可能表明代谢可塑性允许随机性的使用不同的能量途径。这种混合代谢状态下细胞的存在与预测高 HIF-1 活性下这种细胞状态的理论模型一致，这在 RCC 中得到了很好的证实，在细胞系中的观察将这种可塑性与转移联系起来。
接下来在 ICB 治疗的背景下检查了这些癌细胞程序对免疫细胞的潜在影响。比较 ICB 反应者和无反应者，癌细胞群都上调了与干扰素-g 反应和主要组织相容性复合物 (MHC) I 类抗原加工相关的基因，表明反应者对促炎症微环境有反应。然而，ICB 处理的癌细胞也上调了几个 T 细胞检查点分子，在两个群体中具有不同的模式。 TP1 细胞在治疗后强烈上调 nectin-2，而 TP2 细胞在几个检查点分子的表达中具有更温和的增加。比较 ICB 反应者和无反应者，TP2 细胞表现出更显著的差异，广泛上调大量 T 细胞检查点分子和参与减少巨噬细胞炎症和逃避吞噬作用的分子。在队列的一个更同质的子集中概括了分析的发现。总之，结果表明微环境中许多细胞群之间存在复杂的相互作用，两种癌细胞群在 ICB 治疗期间向 CD8+ T 细胞和 TAM 呈现不同的免疫抑制信号。
TP1 cancer expression program associated with improved survival
TP1 和 TP2 癌细胞在肾脏分化、代谢和免疫抑制信号传导方面的差异促使我们在一个大型前瞻性队列中研究它们是否在疾病进展和治疗抵抗中发挥不同的作用。分析生成了描述 TP1 和 TP2 的基因特征，并将这些特征限制在癌细胞特异性基因上。利用scRNA-seq 数据生成癌细胞特异性特征后，在一项比较 mTOR 抑制剂依维莫司和 nivolumab 的随机临床试验 (Checkmate 025) 中对来自晚期 ccRCC 的预处理样本的bulk RNA-seq 进行评分。在多变量分析中观察到治疗前 TP1 评分与仅在接受 nivolumab 的患者中显著改善的总体生存率之间存在关联，尽管放射学反应类别之间的评分水平没有显著差异。在一项包括来自双臂建模治疗组、TP1 评分和治疗-TP1 交互项的患者的联合分析中，观察到 TP1 评分与纳武单抗治疗之间存在显著的交互作用（p = 0.04，Cox 比例风险）。这些结果表明，TP1 评分与生存率之间的关系是由癌症-免疫相互作用驱动的。 TP2评分与生存率之间没有显著相关性。然而，在接受 nivolumab 治疗的患者中，存活率下降与一组免疫检查点和逃避基因的高表达有关，几乎所有这些基因在 ICB 反应者与非反应者的 TP2 细胞中均显著上调，尽管这些基因不是癌细胞特异性（pCox = 0.017）。
为了更好地了解这两个癌细胞程序的病因，评估了它们是否与潜在的基因组特征相关。 在 Checkmate 025 队列中，注意到 PBRM1 和 KDM5C 突变肿瘤的 TP1 评分增加，而具有 9p21.3 缺失的肿瘤的 TP2 评分增加，这些缺失与 ICB 抗性相关。 TP1 评分与 PBRM1 突变和 TP2 评分与 9p21.3 缺失的关联在 TCGA KIRC 队列中得到证实。 在 ICB 治疗的 Checkmate 025 患者中，当将 PBRM1 突变状态作为协变量时，TP1 评分仍然与增加的生存率显著相关。 结合观察与 KDM5C 和拷贝数改变的关联，这表明 TP1 捕获了与单基因突变以外的基因组改变相关的转录模式。
Checkmate 025 ICB 手臂的生存益处促使进一步研究癌细胞亚群和免疫细胞之间的相互作用。使用源自我们数据集的细胞类型表达特征检查了在 Checkmate 025（纳武单抗组）中推断的 CIBERSORTx 免疫细胞群丰度。在 TP1 评分较高的肿瘤中，观察到 4-1BB-Lo CD8+ T 细胞的推断丰度增加，早期指出 ICB 治疗期间效应分子表达的显著上调以及与促进黑色素瘤中 ICB 反应的祖细胞耗尽细胞的相似性。尽管对大量队列中相关免疫细胞群丰度的计算推断具有挑战性，但这些发现支持癌细胞中 TP1 表达程序与癌症-免疫细胞相互作用介导的存活之间的关系。总的来说，对具有不同免疫细胞相互作用的不同肿瘤亚群的观察可能有助于解释在大量 RNA-seq 中观察到的不同 RCC clusters，包括异质浸润的高血管生成肿瘤和非浸润的高代谢肿瘤。
Cell-cell interactions within the tumor microenvironment
鉴于在 ICB-exposed的 4-1BB-Lo CD8+ T 细胞中观察到 IFNG 上调、来自 ICB 应答者的 TAM 中的免疫检查点和逃避基因上调，以及不同的免疫调节癌细胞程序，我们假设不同的细胞群参与复杂的串扰.为了识别可能的非细胞自主效应，我们使用 CellPhoneDB 通过已知的受体-配体对识别不同细胞群之间的推定信号传导。两种癌细胞群都被推断为通过骨桥蛋白（由 SPP1 编码）向表达 CD44 的 CD8+ T 细胞发出信号，骨桥蛋白是一种抑制小鼠模型中 T 细胞活化的相互作用。同样，两种癌细胞群都表达 MIF 和 CD47，向 TAM 上表达的 CD74 和 SIRPa 发出信号，分别促进 TAM 生长因子分泌和抑制吞噬作用的相互作用。然而，只有 TP2 细胞被推断为通过 galectin-9（由 LGALS9 编码）与 CD8+ T 细胞和 TAM 上表达的 TIM-3（由 HAVCR2 编码）结合。通过 TIM-3 发出的信号抑制 CD8+ 细胞毒性细胞活性，并在其他人类癌症中诱导 TAM 分泌生长因子。此外，TP2 细胞表达 nectin-2，它与 CD8+ T 细胞共抑制受体 TIGIT 结合。尽管这种计算机方法不能明确地建立相互作用，但它表明癌细胞对 T 细胞和 TAM 进行复杂调节的可能性。
还观察到 CD8+ T 细胞和 TAM 之间相互作用的证据。与来自 ICB 应答者与无应答者的 TAM 中干扰素应答基因的上调一致，CellPhoneDB 推断出由 CD8+ T 细胞产生的干扰素-g 对 TAM 的调节。在 Checkmate 009 的 ICB 活组织检查中，标准化的 IFNG 水平与 CIBERSORTx 估计的 CXCL10-Hi TAM 分数以及来自我们单细胞队列中的 ICB 暴露与 ICB 幼稚 TAM 比较的表达特征密切相关。在相同的样本中，观察到在具有较高标准化 IFNG 表达的样本中，免疫检查点和逃避基因的表达同时增加，这与其他癌症类型中报告的免疫抑制负反馈回路一致。事实上，比较同一患者的 ICB 前和 ICB 上活检，观察到免疫检查点和逃避特征以及成员基因（包括 VSIG4、PD-L2 和 SIGLEC10）的表达水平增加。其中一些基因由癌细胞和 TAM 表达，它们的起源无法在bulk转录组中破译，但这些比较表明，肿瘤微环境可能通过增加免疫抑制基因表达来适应 ICB 治疗。
DISCUSSION
为了研究免疫系统和癌症对治疗的反应，在 ICB 之前或之后检查了晚期 RCC 的单细胞转录组。 CD8+ T 细胞亚群在应答者中被强烈激活并分化为最终耗尽的表型。这些细胞与在黑色素瘤中被描述为介导 ICB 反应的细胞具有相似性，并且可能对应于被描述为 RCC 中干细胞样 CD8+ T 细胞后代的群体。在 TAM 中，发现了一小部分促炎人群和多个其他人群，这些人群在 ICB 应答者中响应干扰素-g 信号传导而一致地转向促炎表型。 ICB-exposed与 T 细胞检查点分子表达和抗炎信号的增加有关，这表明免疫系统适应可能是治疗抵抗的基础。在癌细胞中，发现了两个通过促血管生成、肾脏分化和代谢程序的表达而分化的群体。作为对 ICB 的反应，代谢可塑性和分化程度较低的 TP2 癌细胞上调了许多免疫抑制基因。虽然在队列中通过活检观察到来自两个群体的细胞，但 TP1 癌症计划的增加与 ICB 的存活率增加有关，这表明癌症-免疫串扰的差异在两个群体之间起作用。
鉴于适度的活检数量，临床异质性对研究构成挑战。几乎所有接触过 ICB 的患者都接触过 TKI，因此观察到的效果可能是由联合用药驱动的。尽管如此，由于 TKI 和 ICB 联合治疗或序贯治疗是标准治疗，研究结果仍然与未来的工作相关。 RCC 最常表现为 ccRCC，我们的数据集反映了这一点。尽管我们已经明确关注在患者中发现的表达程序，但需要对其他组织学进行详细研究。我们在统一处理的bulk 测序临床试验队列中验证了我们的发现，其中包括纵向 ICB 前后活检。尽管如此，bulk RNA-seq 受到未知细胞类型混合物的限制，因此未来的工作应集中在使用单细胞方法的大量配对 ICB 初治和 ICB 抗性活检上。多重成像分析可以阐明在 RCC 中普遍存在的串扰机制。考虑到 TAM 和癌细胞中免疫抑制基因的上调，这尤其紧迫，这可能最终导致耐药性。
Our findings highlight the importance of studying immunomodulatory pathways away from the PD-1 axis, including T cell inhibition by VISTA expressed by both TAMs and cancer cells。Targeting the CD47/SIRPa axis with anti-CD47 antibodies, perhaps in conjunction with anti-PD-1 therapy, may promote macrophage phagocytosis of TP2 cells, which upregulate a broad range of immunosuppressive genes in ICB responders. These investigations are urgent now that ICB is a standard of care, and our findings provide a path toward identifying therapeutic targets and combinations to combat treatment resistance.
Methods
Identification of cancer cells（基因 + inferCNV）
Receptor-ligand interaction inference
生活很好，有你更好
