题目：Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Disease-Defining T-cell Subsets in the Tumor Microenvironment of Classic Hodgkin Lymphoma
发表期刊：Cancer Discovery (IF:39.4)
发表年份：2020-03
摘要
霍奇金淋巴瘤( Classic Hodgkin Lymphoma, cHL)的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由不同类型的非恶性的免疫细胞和恶性细胞(HRS)组成的。细胞成分及其空间关系的特征对于理解TME中的 cross-talk和治疗靶向至关重要。作者对22个霍奇金淋巴瘤组织标本和5例健康对照淋巴结组织进行单细胞转录组测序，总共包含127000多个细胞，首次在单细胞水平揭示了霍奇金淋巴瘤特异性免疫微环境的表型。单细胞表达谱确定了一种新的霍奇金淋巴瘤相关T细胞亚群，该亚群高表达LAG3，确定该LAG3+T细胞群是免疫抑制环境形成的中介物质。微环境中免疫细胞的Multiplexed spatial assessmen评估也显示，MHC II类缺陷肿瘤细胞附近的LAG3+T细胞增加。这些发现为TME生物学提供了新的见解，并为霍奇金淋巴瘤的免疫检查点靶向提供了新的方法。
实验设计及质控
结果
1.单细胞水平的cHL特异性免疫微环境
总共22例cHL患者的淋巴结单细胞悬液，包括12例结节硬化（NS）亚型、9例混合细胞（MC）亚型和1例富含淋巴细胞亚型。同时还有5个健康供者的反应性淋巴结（RLN）进行了测序，作为正常对照）。总共得到127786个活细胞，每个细胞检测到的基因数目中位数是1203。合并了所有细胞（保活cHL和RLN）的表达数据，并进行了批量校正和标准化。最终确定了22个细胞簇(Figure 1A),包括 naïve T-cell clusters, two CD8+ T-cell clusters, six CD4+ T-cell clusters, seven B-cell clusters, one macrophage cluster, one plasmacytoid dendritic cell cluster, and one progenitor cell cluster.大多数免疫细胞表型在cHL和RLN之间均有所重叠，一些特定的细胞簇主要来自cHL。
2.EBV状态对cHL免疫细胞亚群的影响
30%至40%的cHL与EB感染HRS细胞有关，EBV感染可以招募特定的Treg群体到cHL的TME中。于是比较了5个EB+和17个EB-样本，发现在EBV+cHL中，具有Th17特征的CD4+T细胞比例显著降低（Figure 1 F and G）。然而，两组之间的CD8+T细胞或Treg比例没有显著差异（Figure 1 F）。类似地，与cHL NS亚型相比，通常与EBV相关的cHL MC亚型的Th17比例较低(Figure 1 H)。
2.cHL特异性免疫亚群的单细胞图谱
Figure 1B 和D 表明，与RLN相比，cHL中的Tregs较多。于是将分析重点放在Treg亚群上。除IL2RA（CD25）和TNFRSF18（Figure 2A）等常见Treg标记物外，CD4-CD5-Treg亚群还高表达LAG3。然而，其他典型的Treg 细胞marker，如FOXP3在该亚群中表达较低，表明这些细胞可能是I型调节性（TrI）T细胞表型（图2B）。为了证实cHL中免疫细胞的表达模式，还使用多色IHC和IMC评估了所有cHL病例中胞面和胞内marker的表达。证实了CD4+T细胞上的LAG3和FOXP3蛋白质表达水平呈负相关。（Supplementary Figure 6 B and C）。
3.cHL细胞上清能诱导LAG3+ T Cells增殖
接着研究了LAG3+T细胞的细胞因子表达水平。在CD4+T细胞中，LAG3+T细胞的细胞因子IL10、TGFβ和IFNγ的表达高于LAG3− T细胞（Figure 3 A）。这些特征与1型调节性T细胞的特征一致。
4.LAG3+T细胞和HRS细胞的空间评估
接下来，探究LAG3+T细胞和恶性HRS细胞之间的空间关系。病人样本的IHC显示，与RLN相比，cHL TME中富含LAG3+T细胞，并且在一部分cHL病例中，HRS细胞被LAG3+T细胞紧密包围（Figure 4 A）。单细胞分析结果提示，与MHC II类阳性的HRS细胞（n=16）相比，MHC II类阴性HRS细胞（n=6）的LAG3表达显著更高，但与EBV状态或组织学亚型无关（Figure 4 B)。对于CD4-Treg-C5亚群，与MHC II类阳性细胞相比，MHC II类阴性细胞中LAG3上调倍数最大（Figure 4 C）。
接下来，使用一个独立队列来验证LAG3+T细胞存在的潜在预后价值。这队列包括166名患者，进行了ABVD方案治疗(阿霉素、博莱霉素、长春碱和达卡巴嗪）。与scRNA-seq的结果一致，他们发现与MHC-II阳性HRS细胞相比，MHC-II阴性HRS细胞的肿瘤组织中LAG3+T细胞的比例显著高于MHC-II阳性中的HRS细胞，但与EBV状态无关（Figure 5 B and C）。此外，LAG3+T细胞数量增加与DSS和OSS缩短相关(Figure S13 A and B)。，高比例的LAG3+T细胞（>15%）和CD68+肿瘤相关巨噬细胞(≥5%）通过多变量Cox回归分析确定为DSS的独立预后因素（MHC-II表达和IPP评分作为协变量量，Figure S13 C）。最后在一个独立复发性cHL患者队列中（这些患者在接受高剂量化疗后进行自体干细胞移植），同样发现，LAG3+T细胞的增多与不良的存活率相关，尽管未达到统计显著性，可能是由于样本量太少（Figure S13 D）。
cHL中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的串扰
为了研究HRS细胞与cHL微环境相互作用，接下来探索了从原发性霍奇金淋巴瘤样本的显微解剖HRS细胞生成的Affymetrix基因表达数据。发现了MHC阴性样本的细胞因子和趋化因子的表达水平较高（图6A）。IL6是唯一一个在MHC-II阴性HRS细胞中表达显著高于MHC-II阳性HRS细胞的细胞因子。在体外，IL6也可诱导CD4+LAG3+T细胞形成（Figure 6B），表明IL6可能在诱导cHL中的CD4+LAG3+T细胞中发挥作用。
7.去除LAG3+T细胞后，临床样本来源的T细胞被激活
为了证实LAG3+T细胞在cHL临床样本中的致病作用，从4名患者的细胞悬液中分离了CD4+LAG3+CD25+T细胞和剩余的T细胞。然后在体外将T细胞与CD4+LAG3+CD25+T细胞共培养之后，
观察到与LAG3+细胞群共培养的T细胞中的增殖受到抑制，而不与LAG3+细胞群共培养的T细胞中，细胞增殖明显增强，且细胞内细胞因子TNFα的表达显著增加。
研究意义
由HRS细胞的细胞因子和趋化因子诱导的LAG3+T细胞在cHL的TME中起着重要的免疫抑制作用。重要的是，LAG3是正在进行的恶性淋巴瘤临床试验（包括cHL）中的癌症免疫治疗靶点。该研究提示去除LAG3+群体可以作为重新激活T细胞活性的一种手段。虽然目前数据没有证明LAG3+T细胞作为预后生物标记物的价值，尚需要其他队列的进一步验证，但在针对LAG3+T细胞及其细胞相互作用的治疗背景下，评估LAG3+T细胞作为预测性生物标记物的潜力至关重要。特别是，正在进行的针对CTLA4或CD25的LAG3靶向抗体和抗体-药物结合物的试验（将针对LAG3+细胞等）将允许进行这种评估。此外，对包括LAG3+T细胞和其他免疫细胞类型等免疫细胞相互作用生物学的进一步研究，可能有助于未来替代检查点抑制剂的治疗开发。
