质谱

质谱图的基本概念

在质谱图中，横坐标表示离子的质荷比（m/z）值，从左到右质荷比的值增大，对于带有单电荷的离子，横坐标表示的数值即为离子的质量；纵坐标表示离子流的强度，通常用相对强度来表示，即把最强的离子流强度定为100%，其它离子流的强度以其百分数表示，有时也以所有被记录离子的总离子流强度作为100%，各种离子以其所占的百分数来表示。

主要离子峰

分子离子峰

• 分子受电子束轰击后失去一个电子而生成的离子M+称为分子离子，例如：M+e¨→M+ + 2e¨

• 在质谱图中由M+ 所形成的峰称为分子离子峰。因此，分子离子峰的m/z值就是中性分子的相对分子质量Mr，而Mr是有机化合物的重要质谱数据。

• 分子离子峰的强弱，随化合物结构不同而异，其强弱一般为：芳香化合物>共轭链烯>烯烃>脂环化合物>直链烷烃>酮>胺>酯>醚>酸>支链烷烃>醇。分子离子峰的强弱可以为推测化合物的类型提供参考信息。

• 一般来说最大质量数的峰就是分子离子峰，分子离子含奇数个电子，也称母峰,它的质量就是分子量。一般位于质谱图质荷比最高位置的一端,它的质量数是化合物的分子量

  • 奇电子离子：含有一个未成对电子的离子；
  • 偶电子离子：不含未成对电子(即电子全配对)的离子。
  • 相对于奇电子离子而言继续断裂失去自由基可形成偶电子离子。奇电子离子常作为分子离子峰的判定。

• 分子离子峰的判定

  • (1)氮规则

    由C,H,O组成的有机化合物，分子量一定是偶数

    不含氮或者含偶数氮的有机物的相对分子量为偶数；

    含奇数氮的有机物的相对分子量为奇数。

    分子离子峰与相邻峰的质量差必须合理

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• (2)质谱中常见的中性碎片和自由基

  分子离子峰能够合理的丢失碎片(中性碎片和自由基)，与其相邻的质荷比较小的碎片关系合理。而常见的碎片如下表和图所示

  
  
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  有些化合物没有分子离子峰。

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- (3)衍生物比较

  不同衍生物的分子离子峰不同。

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- (4)降低电子流电压

  碎片离子峰强度下降、分子离子峰强度增加。

- (5)用高分辨质谱

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• 分子离子峰强度与分子结构的关系

  (1)碳链越长，分子离子峰强越弱。

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(2)存在支链有利于分子离子峰的裂解，且峰很弱。

正碳离子的稳定性：

叔正碳离子>仲正碳离子>伯正碳离子

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(3)饱和醇类、胺类化合物的分子离子峰很弱

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(4)环状分子一般有较强的分子离子峰

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碎片离子峰

• 当电子轰击的能量超过分子离子电离所需要的能量时(约为50~70eV)，可能使分子离子的化学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子。在质谱图上出现相应的峰，称为碎片离子峰。碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。

同位素离子峰

• 在组成有机化合物的常见十几种元素中，有几种元素具有天然同位素,如C,H,N,O,S,Cl,Br等。所以，在质谱图中除了最轻同位素组成的分子离子所形成的M+峰外，还会出现一个或多个重同位素组成的分子离子峰，如、、等，这种离子峰叫做同位素离子峰。对应的m/z为M+1、M+2、M+3表示。

• 人们通常把某元素的同位素占该元素的原子质量分数称为同位素丰度。==同位素峰的强度与同位素的丰度是相对应的==，下表列出了有机化合物中元素的同位素丰度及峰类型。

  由下表可见，S、Cl、Br等元素的同位素丰度高，因此，含S、C、Br等元素的同位素其M+2峰强度较大。一般根据M和M+2两个峰的强度来判断化合物中是否含有这些元素。

重排离子峰

• 分子离子裂解成碎片时，有些碎片离子不是仅仅通过键的简单断裂有时还会通过分子内某些原子或基团的重新排列或转移而形成离子，这种碎片离子称为重排离子,质谱图上相应的峰称为重排峰。
• 重排的方式很多，其中最重要的是麦氏重排(Mclafferty Rearrangement)。可以发生麦氏重排的化合物有醛、酮、酸、酯等。这些化合物含有C=X(X为O,S,N,C)基团，当与此基团相连的键上具有γ氢原子时，氢原子可以转移到X原子上，同时β键断裂。例如，正丁醛的质谱图中出现很强的m/z=44峰，就是麦氏重排所形成的

亚稳离子峰

• 前面所阐述的离子都是稳定的离子。实际上，在电离、裂解、重排过程中有些离子处于亚稳态。例如，在离子源中生成质量为m1的离子，在进入质量分析器前的无场飞行时发生断裂，使其质量由m1变为m2，形成较低质量的离子。这类离子具有质量为m1离子的速度，进入质量分析器是具有m2的质量，在磁场作用下，离子运动的偏转半径大，它的表观质量m*=[m2]^2/m1，这类离子叫亚稳离子，m*形成的质谱峰叫亚稳离子峰，在质谱图上，==m*峰不在m2处，而出现在比m2更低的m*处==。

• 由于在无场区裂解的离子m不能聚焦与一点，故在质谱图上m峰弱而钝一般可能跨2~5个质量单位，并且m/z常常为非整数，所以m*峰不难识别。

  例如,在十六烷的质谱图中，有若干个亚稳离子峰，其m/z分别位于32.9、29.5、28.8、25.7、21.7处。m/z=29.5的m*，因41^2/57≈29.5，所以m*=29.5表示存在如下裂解机理：C4H9+→C3H5+ + CH4

  m/z=57 m/z=41

  由此可见，根据m1和m2就可计算m*，并证实有m1+→m2+的裂解过程，这对解析一个复杂质谱图很有参考价值。

基峰

在质谱图中相对强度最大的碎片离子峰

质谱图解析的一般步骤

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CID

二级质谱中的诱导碰撞解离（Collision-Induced Dissociation）方式。通过与中性分子碰撞将能量传递给离子的过程。能量传递足以导致键的开裂和重排。

通过CID会产生碎片，碎裂过程如下：ABCD+→ABC+ + D（中性碎片）

电荷保留在质子亲和势较高的碎片上

质谱与色谱

色谱图

Basepeak 图

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Basepeak图是色谱分离过程中将每个时间点质谱检测信号==最强的肽段的强度值==连续描绘得到的图谱。图中峰多信号强说明样品复杂度高量也足。由于上机的样品是蛋白质酶解后的肽段，所以如果你要问小编能否将鉴定到的蛋白质在basepeak图上标出来，答案是不能!!!

TIC图

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全称为Total ion chromatogram，即总离子流图，相比Basepeak图是用每个时间点质谱信号强度最高的母离子绘制的图谱，TIC则是样品中所有离子的色谱图。

XIC图

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全称是Extracted ion chromatogram，即提取离子流色谱图,为某个特定母离子的色谱图，XIC图的峰面积可以用于蛋白定量分析。

质谱

一级质谱图是一次质谱全扫描内所有母离子的信号分布图，二级质谱图是特定母离子在高能碎裂后产生的二级离子的信号分布图，样品经质谱鉴定后生成的质谱文件实质是数万张一级质谱图和二级质谱图的叠加。

原始二级质谱图，如下图(m/z=377.54)，为实际检测到的二级离子的质荷比的分布图，只有一个个孤独的峰，代表一个个孤单的子离子，没有归属，只有将其大小与宗氏族谱(理论的肽段序列碎裂后生成的二级离子分布)匹配后，方能知道其名姓(肽段序列)。匹配后的图就是文章里提到的有注释信息的二级图，也叫做b,y离子匹配图。修饰组学及一段肽的蛋白发文章时可能会被要求提供b,y离子匹配图。

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将实际检测到的二级离子的质荷比分布与肽段序列断裂后理论形成的子离子匹配后的图谱

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肽段在能量作用下断裂后会生成一个个b,y离子对。左面的碎片为b离子，右边的碎片为y离子，以上图为例，KTQAASVEAVK理论生成的b,y离子对为：

第一个氨基酸与第二个氨基酸中间断开(K|TQAASVEAVK)，则生成b1=K(从左往右数1)，y10=TQAASVEAVK(从右往左数10);

第二个与第三个氨基酸中间断开(KT|QAASVEAVK)，生成b2=KT,y9= QAASVEAVK;其他位置断开，依次类推。

本肽段中如果第一个氨基酸K上发生了泛素化修饰(已经标红)，我们应该如何找出该位点被修饰的证据呢?

泛素化是指泛素（一类低分子量的蛋白质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程

肽段碎裂后检测的b3(KTQ),b4(KTQA)离子可能带有修饰集团，以b3为例，如果K上发生修饰，则b3的分子量应该比不带修饰的b3(KTQ)理论分子量(376.22-18.01(QA连接是脱了水的)=358.21)多一个修饰集团glygly-的分子量(114.04)，即=358.21+114.04=472.25，而我们检测到的b3离子的分子量刚好为472.25，说明b3(KTQ)离子携带了泛素化修饰集团.因泛素化常发生在K上，推测应为K发生了泛素化修饰。

区分同位素峰和不同价态的峰

• 同位素峰：从多电荷谱图中选一个峰拉开，即为同位素峰。同位素峰的带电荷量==通通相等==（即价态相同）。

​ 同位素峰之间的==质量M==不同，因为同位素种类，数量不同所造成的。

• 不同价态的峰，即多电荷谱图中所呈现的。比如A峰和B峰，==质量M相等，但带电荷量不同==。可设电荷为n，联立方程算出n。

• 无论从同位素峰还是不同价态峰来算n，最终目的都是求质量M！

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以1137.0597拉开后的同位素峰中的1137.0455与1137.2958为例，1137.2958-1137.0455=0.2503 ，1/Z=0.2503 , Z=4, 所以M=4×==1136.5450===4546.18 ==要以第一个原型峰来算M!!== 所以1137.0597为4价，物质质量为4546.18

但，4546.18不准，它还带了4个H，所以要减去这个重量，所以精确的M=4546.18-4×1.0078=4542.1488

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​ 设1654.3103所带电荷为n，则1819.6238所带电荷为n-1,联立方程得：1654.3103n=1819.6238(n-1)，n=11.007(n的值一定要接近整数，小数位后要够小，若为11.500左右则不行)

所以M=n×1654.3103-11×1.0078

功能肽因子的氨基酸组成及序列鉴定

• 在质谱分析中，物质被离子化后按离子的质荷比 (m/z) 大小进行分离，通过测量各种离子谱峰的强度而达到分析的目的。电喷雾电离 (ESI) 属于最软的电离方式，通常只产生分子离子峰，适宜中等极性到强极性化合物分子的分析，能分析小分子肽及大分子蛋白等。ESI 电离小分子得到 [M+H]+ 或 [M+Na]+等单电荷离子，而电离生物大分子（如蛋白质和 DNA 等）则产生多电荷离子。通常来说，正离子扫描模式适合于碱性样品，样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式；负离子扫描模式适合于酸性样品，样品中含有较多的强负电性基团如含 CI、Br 等时可使用负离子模式。