操作步骤:
1. 请自行准备:无水乙醇、异丙醇、生理盐水及 1.5mL 去 RNA 酶离心管。
2. 取出洗涤液,按 70%比例加入无水乙醇,9mL 加入 21mL 无水乙醇,18mL 加入 42mL 无水乙醇,混匀。
3. 样本处理:
3.1 微量组织:a)活检、冰冻组织,先用液氮研磨为粉末,转入 1.5mL 离心管内,加入 100 μL 生理盐水,混匀,进入步骤 4;
b)穿刺组织,体积小于 50μL,加入 50 μL 生理盐水,转入 1.5mL 离心管内,混匀,进入步骤 4;50-100 μL 穿刺液,混匀,直接进入步骤 4;大于 100 μL,2000rpm 离心 5 分钟,吸弃部分上清,留下 100 μL 上清,振荡混匀,进入步骤 4。
3.2 微量细胞:a)胸腹水、尿液、脑脊液等,2000rpm 离心 5 分钟,吸弃部分上清,留下 100 μL 上清,振荡混匀,进入步骤 4。
b) 培养细胞,先制备成细胞悬液,转入 1.5ml 离心管,2,000 rpm 离心 5 分钟,弃部分上清,留 100μL 上清,混匀,进入步骤 4。
4. 加入 200μL 裂解液、3μL Carrier 和 20μL 消化液,振荡混匀,65℃温育 10 分钟至细胞完全裂解。
5. 加入 450 μL 无水乙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响核酸的提取与后续实验。
6. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,12,000 rpm 4℃离心 1 分钟,弃收集管内废液。
7. 按每份样本 40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。
8. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液至吸附柱内,静置 2 分钟,12,000 rpm 4℃离心 1 分钟,弃收集管内废液。
9. 将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 4℃离心 1 分钟,离去残留的洗涤液。
10. 取出吸附柱,放入新的 1.5 mL 去 RNA 酶离心管内,加入 40 μL 预热的洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 4℃ 离心 1 分钟,收集核酸溶液。提取的核酸即可用于下一步实验或-70℃保存。
注意事项:
1. 为防 RNA 酶污染,实验过程中最好戴一次性干净手套、口罩,使用处理过的无 RNA 酶的容器和无 RNA 酶的超纯水。
2.裂解液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻,洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀。