操作步骤:
1. 请自行准备:无水乙醇、异丙醇、生理盐水、1.5mL 灭菌 RNase-free 离心管。
2. 取出洗涤液,按终浓度 70%比例加入无水乙醇,如 3mL 加入 7mL 无水乙醇,6mL 加入 14mL 无水乙醇,充分混匀。
3. 取 1.5mL 离心管 1 支,加入 1mL 生物样本,再加入 160μL 氨基裂溶液,Vortex 强烈振荡 15 秒,再加入 1μL BIOG 促裂酶,振荡混匀,室温放置 15 分钟;
4. 13,000rpm 离心 10min,尽量吸弃上清,注意不要触动管底沉淀,加入 0.1mL 生理盐水,Vortex 强烈振荡,至管底沉淀完全分散,无明显结块;
5. 加入 25uL 裂解酶 R,混匀,37℃放置 25 分钟。3,000 rpm 离心 15 秒,轻振至管底沉淀完全散开;
6. 加入 150μL 裂解液和 20μL 裂解酶 P,振荡混匀,65℃放置 15 分钟;
7. 加入 450μL 异丙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响核酸的提取与后续实验;
8. 将 PINNA 纯化柱放入收集管内,将上述溶液全部转入 PINNA 纯化柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液;
9. 将 PINNA 纯化柱放回收集管内,加 400μL 洗涤液至 PINNA 纯化柱内,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
10. 将 PINNA 纯化柱放回收集管内,加 400μL 洗涤液至 PINNA 纯化柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。同时,按每份样本40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL RNase-free 离心管,65℃预热。
11. 将 PINNA 纯化柱放回收集管内,12,000 rpm 离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。
12. 取出 PINNA 纯化柱,放入新的 1.5 mL 灭菌 RNase-free 离心管内,加入上述预热的 40 μL 洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 2 分钟,收集核酸溶液。提取的核酸即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项:
1. 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻,氨基裂和促裂酶应配合使用,不同试剂盒中的同一成份不要换用。
2. 洗涤液最好现用现配,按需计算用量后配制。加入乙醇后的洗涤液如使用不完,2-8℃密封保存不超过 1周。
3. 由于核酸容易降解,提取实验所用器具应除去 RNA 酶,实验过程中最好戴一次性洁净手套、口罩,提取的核酸溶液可适当加入核酸保护因子。