该综述发表在Chemical Reviews杂志上，影响因子高达54.301分，对细胞外囊泡的研究方法总结非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，这篇综述都有介绍，十分详尽！通讯作者是哈佛大学的Hakho Lee教授。
Extracellular Vesicles (EVs) 细胞外囊泡是由细胞主动释放的多样的纳米级膜囊泡。类似大小的囊泡可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类(如外泌体、微囊泡)。虽然EVs最初被认为是细胞碎片，因此未被重视，但现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信和疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体。
该综述的内容包含：
- Introduction
- EV的形成、内含物
- 物理特征（电镜、纳米颗粒分析等）
- EV的富集方法（分为传统的高通量方法，如超速离心、密度梯度离心、沉淀法、分子排阻法、场流分级法；新方法，如微流控法、非接触法、免疫吸附法）
- EV蛋白的分析（首先分膜蛋白和内部蛋白；然后介绍分析方法，传统法包括WB、ELISA、质谱等，新方法包括小颗粒流式等）
- EV核酸分析（分mRNA、miRNA和其他RNA、DNA分析等）
- EVs的临床应用（主要介绍了其在癌症的诊断应用，如成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等；神经退行性疾病和急性器官损伤；及其治疗上的潜力）
- 总结和展望
1. INTRODUCTION
生物流体（Biofluids）中含有大量的EVs，这些EVs可以从Parental Cells转移不同的分子去其他细胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。
2. EV BIOGENESIS AND CONTENTS
根据其生物起源，EVs主要分为三大类：外泌体、微囊泡和凋亡小体。本文侧重前两类，因为它们产生于活细胞。
2.1 Vesicle Formation
EV的细胞释放是通过质膜的向外出芽（微囊泡途径）或通过内体膜的内向出芽（外泌体途径）发生的。 外泌体是内吞起源的囊泡。 质膜向内侵入形成早期的内体后，内体[现在称为多囊体(MVB)]限制膜进一步向内萌芽，形成为腔内囊泡。最后，外泌体通过MVB与质膜的融合被分泌。
质膜双层具有不对称的磷脂分布。 分布受三种主要蛋白质控制：内向泵，对磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺具有特异性的脂肪酶； 外向泵，一种絮凝酶； 脂质加扰酶，可促进脂质在双层中的双向重新分布。 细胞刺激后，脂质重新分布，导致微囊形成和释放。
2.2 EV Molecular Contents
EV的形成决定了其膜组成。
微小囊泡的膜组成最能反映其Parental Cells(母细胞)的质膜。
相反，外泌体中已经鉴定出特异性的内体蛋白分子，这反映出外泌体形成的机制。内体分选复合物（ESCRT）已被广泛认为用于调节和引导特定分子进入MVB的腔内囊泡。ESCRT及其四个主要复合物（ESCRT 0，I，II和III）负责传递泛素化蛋白，用于溶酶体降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改变外泌体的蛋白质含量和细胞释放外泌体的速率。更有趣的是，发现外泌体富含ESCRT系统的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌体识别的标记。
ESCRT不是介导外泌体形成的唯一机制。其他不依赖ESCRT的过程似乎也能以相互交织的方式参与其形成和分泌。外泌体也富含ESCRT非依赖性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被证明参与内体小泡运输。小GTP酶的Rab家族参与小泡运输和与质膜融合表明这些蛋白在释放外泌体中的作用。另外，外泌体中神经酰胺水平升高，抑制鞘磷脂会引起的外泌体释放减少，表明鞘磷脂酶与囊泡释放有关。
外泌体和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非编码RNA。自从最初发现EV含有RNA，人们一直非常关注EV RNA用作诊断生物标志物。在开创性的工作中，Skog等人发现胶质母细胞瘤患者的血清外泌体含有特征性的突变mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供诊断信息。这些核酸的发现导致了这样的假设，即EVs可以在细胞之间转移遗传信息。确实，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有转移进入宿主细胞后仍然可以翻译的mRNA。EV中也有逆转座子和其他非编码RNA的表达。逆转录转座子序列和miRNA以及可翻译的mRNA都通过EV进行转移，这些成果突出了EVs作为遗传信息的载体和传播者的重要性。
3. PHYSICAL CHARACTERIZATION
3.1 Microscopy-Based Methods
虽然传统的光学显微镜的衍射极限接近EV的大小，但是不能产生清晰的图像。高分辨率EV图像需要通过电子显微镜(EM)或原子力显微镜(AFM)得到。然而，这些方法的通量有限，因为需要专门的染色方案和设备。
3.1.1. Scanning Electron Microscopy. 扫描电子显微镜
（a）扫描电子显微镜（SEM）提供三维的表面拓扑信息。
3.1.2 Transmission Electron Microscopy. 透射电子显微镜
（b）透射电子显微镜（TEM）具有出色的图像分辨率，可结合免疫金标记一起使用来提供分子表征。
3.1.3. Cryo-Electron Microscopy. 冷冻电镜
（c）冷冻电镜（cryo-EM）无需大量处理即可分析EV形态。
3.1.4. Atomic Force Microscopy. 原子力显微镜
（d）原子力显微镜（AFM）可以提供表面拓扑信息和微环境的特性（例如刚度，附着力）。
3.2. Dynamic Light Scattering
动态光散射(DLS)，也称作光子相关光谱或准弹性光散射，是一种物理表征手段，用来测量溶液或悬浮液中的粒径分布，也可以用来测量如高分子浓溶液等复杂流体的行为。当光射到远小于其波长的小颗粒上时，光会向各方向散射（瑞利散射）。如果光源是激光，在某一方向上，我们可以观察到散射光的强度随时间而波动，这是因为溶液中的微小颗粒在做布朗运动，且每个发生散射的颗粒之间的距离一直随时间变化。来自不同颗粒的散射光因相位不同产生建设性或破坏性干涉。所得到的强度随时间波动的曲线带有引起散射的颗粒随时间移动的资讯。动态光散射实验易受灰尘或杂质影响，故样品的过滤和离心十分重要。
动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。
动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。
在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是动态光散射技术由于是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。
3.3. Nanoparticle Tracking Analysis
纳米粒子跟踪分析(NTA)是一种光学粒子跟踪方法，用于确定粒子的浓度和大小分布。用光束照射样品中的粒子。当粒子散射光并经历布朗运动时，摄像机记录下每个粒子的路径以确定平均速度和扩散率。与DLS的体散射测量不同，NTA跟踪单个粒子的散射。
然后，此信息将用于数学计算浓度（即视野中的粒子数量）和尺寸分布（即通过Strokes-Einstein方程的流体动力学直径，图5b）。 为了准确定量异质囊泡的浓度和大小，NTA程序需要精确优化摄像头和分析设置。 可能需要使用不同设置进行单独测量，以获取异质混合物中EV子集的准确读数。
3.4. Tunable Resistive Pulse Sensing
可调电阻式脉冲传感(TRPS)可以替代NTA，用于测量EV浓度和尺寸分布。该技术基于纳米级的库尔特原理。它检测离子流的瞬态变化，该瞬变是由囊泡通过聚氨酯膜中尺寸可调的纳米孔的传输而产生的。最近，Akers等人的直径NTA始终比TRPS检测到更多的EV。 对于较大的EV（> 150 nm），情况恰恰相反。这种差异表明感知机制上的差异，并表明需要协同多平台去阐述EV特性。
3.5. Single EV Analysis (SEA) Method
在最近的一篇论文中，描述了一种光显微镜下的单一EV分析(SEA)技术，该技术能够在单个囊泡中进行稳健的、多组分的蛋白质生物标志物测量。在这种方法中，EVs被固定在微流控腔内，免疫染色并成像。当小泡固定在晶片表面时，每个小泡的信噪比通常比溶液中或流动状态下的小泡的信噪比高得多。作者进一步调整了以前用于多重循环细胞和组织分析的图像循环过程，以补足EV的纳米级尺寸。具体来说，作者使用衍生自三种同基因多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞系的EV， EV一次染色三个蛋白质标记，然后进行四轮循环成像。结果表明，EVs生物标志物的异质性很高。然后使用t分布随机邻居嵌入（tSNE）对数据进行可视化； 无监督聚类揭示了潜在的EV亚群的存在。SEA技术可能是研究各种EV类型的强大工具，可提供有关生物标志物表达异质性，标记组成和鉴定EV亚群的丰富数据集。
4. EV ENRICHMENT
EVs在大小、起源和分子组成上都是异质性的；除此之外，它们还存在于不同的复杂的生物流体中，包括血、胸腔积液、腹水、乳汁、唾液、脑脊液和尿液。这些流体中还含有大量的非囊泡大分子结构，可能会干扰EV的分析。所以EV的分离和富集显得尤为重要。
4.1. High-Throughput Bulk Methods
超速离心法（80%）和密度梯度离心法（20%）是最常见的两种高通量混合分离法。根据它们分离机制，这些方法可以分为三大类:密度、亲和和大小。
4.1.1. Ultracentrifugation.
用不同的离心力将颗粒分离:以较低的离心力(300g)去除细胞碎片，而以较高的离心力(100000g)对EV进行沉淀和浓缩。尽管该方法是应用最广泛的金标准，但它也有许多缺点，如体积大、仪器昂贵、处理时间长、过程繁琐、被聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染以及需要大量的样品。
4.1.2. Gradient Ultracentrifugation
蔗糖梯度离心法是一种更为严格的超速离心法，它有助于进一步分离不同密度的囊泡，通常用于分离外泌体(悬浮密度为1.15至1.19 g/mL)。在这种方法中，一个包含不同大小囊泡和大分子的样品在一个密度从上到下递增的梯度表面上被分层。在离心过程中，不同的分子以不同的速率通过梯度沉积。由于其分辨率更高，该方法被认为可以分离更高纯度的EVs(特别是外泌体)；然而，它面临着许多与超速离心法相关的限制。更加新的等渗梯度(如碘黄醇梯度)法被认为效果更好。
4.1.3. Co-Precipitation
最近，基于聚合物共沉淀法的商业试剂盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被开发用于EV富集。这些试剂采用降低EV的水合作用(从而降低溶解度)导致沉淀，然后在低离心力的情况下，沉淀的EV产物可以很容易地、重复性地分离出来，从而避免了长时间的超速离心法操作。然而，这些试剂盒对于大规模使用来说是昂贵的，而且对于EV来说缺乏特异性。该方法还容易产生非均相聚合物颗粒。由于这些试剂均降低了EV和蛋白质的溶解度，因此该方法还可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA复合物。因此，共沉淀法作为EV分离方法受到了限制。
4.1.4. Size-Exclusion Chromatography
大小排阻色谱法根据它们的分子大小通过凝胶过滤来分离囊泡和其他分子。这种凝胶由含有特定大小分布孔隙的球形珠组成。当样品进入凝胶时，小分子扩散到孔隙中，而大分子则直接洗脱。因此，大分子比小分子更早地离开色谱柱，这使得分子的停留时间与色谱柱的大小相关联成为可能。近年来，该分离方法已被应用于从复杂的生物媒介中分离纯化囊泡。Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon等商业公司也正在开发商业的产品以简化EV富集，这些产品的排除柱都大约是75纳米孔径的树脂。蛋白质和其他较小的污染分子被滞留在孔径中，而较大的囊泡(>75 nm)可以迅速通过并在空隙中被洗脱。大小排阻法可将EV与可溶性蛋白分离；为提高分离的效率和分辨率，需要考虑多种因素，包括介质类型、孔径、EV与介质之间的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。
4.1.5. Field Flow Fractionation
场流分馏是另一种分离技术，该技术垂直于样品流施加一个力场，使不同大小和分子量的分离成为可能。近年来，一种非对称流场流分馏技术(AF4)被应用于EV的分离。AF4在通道边界处有一个可渗透板块。当样品在通道中流动时，由于层流流动，流体在边界处的速度比在中心处的速度慢，所以形成了抛物线速度剖面。当施加垂直力场时，样品中的分析物被推向边界。布朗运动产生一种抵消运动，使较小的粒子趋向于离边界更远的平衡位置。这种类型的分离范围广，适用于各种洗脱液。
4.2. New Enrichment Methods
为了提高复杂生物流体的EV分离效率和特异性，人们开发了多种新的EV富集方法。然而，与传统方法相比，这些新方法中的大多数具有较低的吞吐率，应加以解决使之变得实用。
4.2.1. Microfluidic Filtering
基于分子大小的分离是一种很有潜力的方法，可以将EV与大型细胞碎片分离开来。各种微流体过滤系统已经被开发出来，用于从大的细胞碎片和蛋白质聚集物中分离EV，这些系统大部分是基于分子大小差异。例如,Rho等人构建了一种微流控设备，该设备使用膜过滤器对未处理的血液样本进行筛选，来分离EV。膜过滤器的大小∼1μm。在膜的下方插入一个毛细管，用于引导过滤后的EV进入收集通道。膜过滤器和毛细管导向器夹在两个环形磁铁之间；这种设置在进行大量的样品处理时可以方便地更换过滤器集。
4.2.2. Contact-Free Sorting
Lee等人最近使用声波以无接触方式对EV进行细分。这种分离利用超声波驻波，根据囊泡的大小和密度对其施加不同的声交互作用力。该装置由一对相互交错的换能器(IDT)电极组成，用以产生跨流动通道的驻波表面声波。
4.2.3. Immunoaffinity Enrichment
免疫亲和捕获的简便性使其成为一种有吸引力的方法。在这种方法中，利用常见EV标记物（包括四跨膜蛋白（例如，CD9，CD63和CD81）以及与肿瘤相关的标记物（例如，EGFR和EpCAM））的特异性抗体捕获EV。目前已经有各种微流体装置以用于EV的选择性分离。赵等，最近开发了一种微流体ExoSearch芯片，该芯片可使用免疫磁珠持续混合和分离EV。芯片由一个Y形注射器和一个蛇形流体混合器组成，用于孵育和免疫磁珠结合EV。然后可以将结合有EV的磁珠通过磁力保留为紧密的聚集体，用于下游光学检测。该方法可轻松应用于实时监控环境中进行小规模富集。但是，这些方法主要取决于标记，因此往往会低估计数。抗体-抗原结合的强大亲和力也使分离捕获的EV进行后续功能分析变得颇具挑战性。
5. EV PROTEIN ANALYSIS
5.1. Proteins Enriched in EVs
EV蛋白主要来源于胞质膜、胞质醇，而非其他胞内细胞器(如高尔基体、内质网、细胞核等)。EV蛋白质的构成提示了囊泡的生物发生和cargo sorting(这个翻译有点怪)。因此国际细胞外囊泡组织建议应该仔细鉴定EV蛋白，特别是跨膜蛋白和胞质蛋白。
5.1.1. Membrane Proteins.
在哺乳动物中，跨膜蛋白和脂质结合的细胞外蛋白(如内贴蛋白)都与微囊泡和外泌体有关。外泌体的跨膜蛋白富含四聚体蛋白(如CD9、CD63和CD81)一个具有四个跨膜结构域的蛋白质超家族。四聚体蛋白参与细胞膜的转运和生物合成的成熟，在外泌体中高表达，这一特性使得四聚体蛋白被用于外泌体的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚体蛋白并不只在外泌体中唯一表达。另一方面，微囊泡富含整合素、选择素和CD40配体，表明它们来自于细胞的质膜，EV富含特异的跨膜蛋白受体(如表皮生长因子受体/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮细胞黏附分子/EpCAM)。由于许多跨膜蛋白参与了正常生理和疾病的发病机制，它们被用作重要的病理生理学EV生物标志物。
5.1.2. Intravesicular Proteins
EV相关的囊内蛋白具有多种功能。它们包括具有膜或受体结合能力的参与囊泡运输的胞质蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV还富含细胞骨架蛋白(如:内酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侣蛋白(如:热休克蛋白/HSPs)、代谢酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶/GAPDH和核糖体蛋白)。有趣的是，最近的研究发现EV蛋白可以被受体细胞有效地运输和接收，从而在体内和体外引起强烈的细胞反应。这带来了EV作为治疗和药物载体的新机遇。
5.2. Conventional Protein Analyses
EV蛋白的定量和特征鉴定不仅对阐明EV的生物发生和cargo sorting有重要意义，而且对鉴别生理和病理标志物也有重要意义。然而，传统的蛋白质分析，包括Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)，通常需要大样本量、大量处理和/或庞大的专门仪器，因而不太适合临床应用。
5.2.1. Western Blotting and ELISA.
在EV蛋白评估时，Western blotting可能是最常用的技术，用于提示与EV相关的靶蛋白的存在。在这个过程中，纯化的囊泡制剂(通常通过现行的梯度超离心法金标准制备)可以用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲裂解液进行处理。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)分离蛋白裂解物，然后转移到膜上，对特定的蛋白target进行免疫印迹。虽然这种方法有很长的准备和处理时间(> 10h)，但是Western blotting可以提供关于蛋白质分子大小的有用信息。
5.2.2. Mass Spectrometry
不像Western blotting，ELISA只能在相对较小的范围内对目标蛋白进行定量，质谱分析可实现高通量肽谱分析。纯化的EV制剂经过酶消化和肽分离，然后用质谱仪电离分析。在这个复杂的过程中，多个步骤严重影响EV蛋白组学分析。除了有效的EV纯化，质谱分析之前的肽分馏被认为是鉴定囊泡蛋白的一个重要前提。通常通过三种主要方法实现：(1)SDS−PAGE，(2)二维液相色谱和(3)基于等电聚焦的分馏。
值得注意的是，既然质谱分析可以鉴定消化后的肽片段，那么适当的蛋白质鉴定、定量和验证是必要的。已经有两种用于定量的技术方法：基于标签的和无标签的。在基于标签的定量分析中，标签(等压或同位素)被用于比较分析。无标签的定量分析中，色谱强度的谱计数被应用。识别出的候选蛋白可以使用其他传统的蛋白质技术如Western blotting进行验证。在检测灵敏度方面，质谱法通常不如基于抗体的技术敏感。
虽然质谱分析需要大量的准备和处理时间(数天)，但它可以提供高通量、定量和EV比较蛋白质组分析。到目前为止，已有成千上万的囊泡蛋白被系统分类，蛋白质-蛋白质相互作用分析。基于质谱的哺乳动物和细菌EV的蛋白质组学分析的详细讨论已经在一些综述中被强调。这些网络和相互作用的研究有助于阐明EV载体的功能活动及其在细胞间远距离通信中的重要作用。
5.3. New Protein Analyses
为了解决EV蛋白质定量相关的技术挑战，新一代生物传感器正在开发中。与传统的蛋白质检测方法相比，这些生物传感器利用独特的传感机制，可以检测各种大小和分子含量的EV。这些技术中的许多只需要更小的样本量和更少的样本处理过程，因此非常适合于医疗应用。
5.3.1. Small Particle Flow Cytometry
流式细胞术是一种基于光散射和荧光激活来分选单个大颗粒(如细胞或微米大小的实体)的强大的技术，然而，传统的流式细胞术对检测直径小于500 nm的小颗粒的灵敏度和分辨率有限。此外，它还受到高光学背景的影响，由于鞘层流体中存在小颗粒(约200 nm)。用传统流式细胞术量化EV时，大量的小EV可能被忽略或者计数偏低：可能同时有多个小的囊泡被照亮被计数成一个单独的事件，这种现象被称为“群体理论”。
为了解决传统流式细胞术的弊端，微米大小的乳胶珠被用来绑定多个囊泡。然后用荧光抗体对结合的EV进行染色，并对其蛋白标记物进行鉴定。然而，这种方法缺乏分析单个囊泡的能力，并且不能区分不同的囊泡亚群，这可能会导致特征的丢失。
5.3.2. Micro-Nuclear Magnetic Resonance
该技术主要基于磁性纳米粒子(MNPs)。由于大多数生物物质天然缺乏铁磁背景，这种传感几乎不受同系统中其他生物样品的干扰。因此，即使光学上浑浊的样品对磁场也是透明的；当靶分子被特定的MNPs靶向时，它们与自然的生物背景形成了强烈的对比。在基于核磁共振(NMR)的磁检测中，MNPs置于NMR磁场中，产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫率，放大分析信号。因此，核磁共振减少了样本处理过程，提高了检测灵敏度，已经被开发用于多个医疗点应用(例如，直接从血液样本中检测循环肿瘤细胞和细菌)。
但是将这种技术运用在EV检测上却遇到了挑战，因为EV明显比肿瘤细胞小1到2个数量级。Shao等人开发了一种专门用于EV检测和蛋白质分析的新分析技术。此方法采用两步生物正交点击化学方法来标记EV，这种小分子(<200 Da)标记策略并没有显著增加抗体或MNP的大小，从而提高了从非结合抗体和MNPs中保留目标囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μNMR)直接测量EV来确定EV生物标志物的丰度。
相比传统的蛋白技术，μNMR系统表现出更好的检测灵敏度：比WB和ELASA灵敏103倍。Shao等人利用这种集成技术可研究在培养皿中生长的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系中的EV。比较蛋白分析证实，EV确实反映了其亲代细胞的蛋白概况，组合GBM的四种标志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)
R132H)可用于区分癌症来源的EVs与宿主细胞来源的EVs。
5.3.3. Nanoplasmonic Exosome (nPLEX) Sensor
鉴于EV的尺寸小，一种新的快速无标签EVs检测方案：表面等离子体共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金属介电界面上传导电子的集体振荡。不同于其他基于时敏荧光和化学发光探针的光学检测方法，SPR传感检测金属-介电介面附近生物分子结合相关的局部折射率变化，应用于无标签和实时检测。
5.3.4. Integrated Magnetic-Electrochemical Exosome (iMEX) Sensor
Jeong等人最近开发了一种新的便携式传感器，集成磁-电化学外泌体(iMEX)，用于EV的快速、流线型分析。iMEX的一个独特之处在于将外泌体的分离和检测整合到一个单一的平台中：磁珠用于EV捕获和标记，然后用电化学传感来检测EV。这种方法有许多实际的优点: (i)细胞特异性外泌体可以直接从复杂培养基中分离出来，而不需要繁复的过滤或离心; (ii)该方法结合了磁富集和酶促扩增的优点，可以实现较高的检测灵敏度; (iii)通过电检测方案，传感器可以很容易小型化和并行扩展测量。
5.3.5. ExoScreen
除了上述的平面传感器外，Yoshioka等人最近开发了一种放大的、基于溶液的发光近距离均匀分析方法，用于快速、灵敏地分析EVs，特别适合应用于液体活检。作者使用光敏剂珠作为直接报告剂，在血清蛋白分析前不需要任何纯化步骤。与ELISA相似，本试验需要两种类型的免疫珠：(1)供体珠，受680纳米激发释放单线态氧，(2)受体珠，仅在离供体珠200 nm范围内被615 nm激发释放单线态氧。在单个EV上同时结合供体珠和受体珠才能产生信号（只适用直径< 200 nm的小泡）。因此，这种设备被称为“外泌体扫描器”，因为它适用于更小的EVs(如外泌体)，可用于多种疾病的生物标志物筛选。该检测采用先混合再读取的形式：生物样本首先用生物素化抗体处理，受体珠与第二抗体结合。然后加入涂有链霉亲和素的供体珠以完成近距离分析以获取数据。可以在2 h内完成从5μL血清样本开始建立分析的过程。
5.3.6. Comparison
这些新技术相比于传统的方法就是不需要太多的样本量和复杂的分离提纯过程，可以运用微量样本快速获取分析结果。对比这些新方法的差异可以总结如下：基于珠子的流式细胞术或nPLEX非常适合于高通量筛选，并且比其他方法具有更高的敏感性。然而，这些方法是昂贵的，需要专门的仪器。iMEX和microNMR是互补的系统，可以在较低的设备成本和生物流体吞吐量下实现点检测。nPLEX和iMEX均已通过大量临床研究得到验证，目前正在商业化。小颗粒流式细胞术尚处于发展阶段，其本身的吞吐量较低；个别EV应缓慢通过检测区，以确保长时间的逗留以获得良好的信噪比。
6. EV NUCLEIC ACID ANALYSIS
6.1. Nucleic Acids in EVs
EV包含不同形式的RNA和DNA，如下表
RNA是EV携带的主要核酸。与细胞中的RNA相比，eEV运输的RNA通常更短(通常<200个核苷酸，但也有长达5 kb的)。它们主要是非编码rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、长链非编码RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。编码mRNA (mRNA)已在长度为200~1000个核苷酸的转录组中被识别。mRNA可以翻译成蛋白质，而miRNA可以调节受体细胞中靶mRNA的翻译。EV中RNA的数量和性质可以根据其来源的细胞类型而变化。
由于它们在受体细胞中保留了功能，研究人员提出了有趣的假设，即可能存在专门的机制将不同的RNA分配给EV运输到特定的受体细胞，或可能利用这些机制运送治疗性RNA到特定的部位。这是一个活跃的研究领域，已经有一些综述对其进行阐述。
6.1.1. mRNA
近年来的研究发现，EV中含有相当比例的母细胞的mRNA，其中许多是细胞特异性的mRNA。这些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保护其不被RNA酶降解，使它们成为强有力的循环生物标志物。
此外，已在多个研究中得到证实：EV中一些<2 kb的mRNA分子能够编码支持蛋白质合成的多肽(即，蛋白质翻译的功能)。这些研究强调了EV作为特定的细胞信使在影响受体细胞和促进细胞间通讯等多方面的作用。
6.1.2. miRNA
miRNA是一类小的非编码rna(一般为17 - 24个核苷酸)，通常通过靶向mRNA的3’非翻译区介导转录后基因沉默。通过抑制蛋白质的翻译，EV miRNAs在许多生物过程中都是强有力的调控因子。不同于EV中的循环mRNA，miRNA可以以多种稳定形式存在于体液中。除了被包裹在EV中，循环miRNA还可以被加载到高密度脂蛋白或结合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的证据表明，虽然大多数循环miRNA都与RNA结合蛋白相结合，但在EV中也能发现少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。与mRNA的情况一样，EVs中的miRNA表达反映了其细胞来源，但与亲代细胞略有不同。一些miRNA已被发现优先表达在EV中，并在受体细胞中保持功能以调节蛋白翻译。最近的研究还发现，在哺乳动物细胞培养中常用的胎牛血清可能在体外EV制备过程中导致miRNA伪影。
6.1.3. Other RNA Types
通过NGS，我们还发现有其他类型的RNA存在EV中。这些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及长链非编码RNA (lncRNA)。参见上表。
6.1.4. DNA
最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。这些DNA是双链片段，范围从100个碱基对(bp)到2.5 k bp，EV外部还有一些与之相关的>2.5k bp的DNA片段。这些片段代表整个基因组DNA，可用于鉴定亲代肿瘤细胞中存在的突变。虽然有可信的证据表明在EV中存在DNA，但其功能尚未确定。
6.2. Conventional Extraction and Detection Tools
EV核酸作为一种潜在的循环生物标志物和受体细胞间的调节因子已被广泛研究。传统的核酸提取和分析工具已经成功地为我们理解EV核酸奠定了重要的基础。由于EVs中核酸的含量较低，开发高效的提取方法和灵敏的检测策略是非常重要的，特别是在小样本中对稀有目标分子进行检测。
6.2.1. Precipitation and Spin Columns
外泌体核酸的提取方法多种多样。这些通常包括苯酚-氯仿萃取和旋转柱技术。与细胞RNA提取一样，基于酚类物质的方法依赖于离心分离：核酸与水相分离，通过乙醇沉淀回收。这种方法费时费力，但有可能提取高纯度RNA。另一方面，自旋柱是一种固相萃取方法，能够快速纯化RNA。该方法依赖于在潮向性试剂存在下核酸与二氧化硅的强结合，可在苯酚-氯仿萃取后实施，以方便处理。
6.2.2. Amplification and Sequencing
提取外泌体核酸要经过不同的分析模式：除了验证核酸的质量外，通常还要考虑产量、大小、扩增和测序方法等来检测和定量EV中的核酸。例如，一个目标序列可以通过聚合酶链反应(PCR)选择性扩增，并通过终点电泳或实时荧光测量检测(RT - PCR)。虽然这些方法的通量有限，但有助于定量外泌体中已知的目标序列。对于未知的外泌体RNA转录本的高通量发现和定量，NGS做出了重要贡献。基于序列的RNA分析可以产生数百万个具有良好读取深度和覆盖范围的片段，从而有助于从整个转录组(包括已知和未知的RNA)进行分析和探索。这样的综合分析可能为外泌体介导的分子效应机制提供进一步的见解，并有助于生物标志物的发现。
6.3. New Extraction and Detection Technologies
随着人们对利用EV核酸作为微创诊断标记的兴趣日益浓厚，新的生物传感器技术已被开发出来，使提取和分析变得更加高效、快速。这些新平台中有许多提供了对目标核酸标记的敏感定量，并且能够在复杂的生物学背景下识别疾病标记，甚至包括单核苷酸点突变。这为个性化临床医疗开辟了许多新的机会。
6.3.1. Droplet PCR
虽然传统PCR是检测基因/转录突变的强大技术(例如，EGFRvIII缺失突变)，但其敏感性有限，其在检测单核苷酸突变方面存在很多不足。这个问题与EVs特别相关，因为在野生型转录本的大背景中，突变转录本的比例很低。Chen等人最近采用了一种液滴数字PCR (ddPCR)技术来检测EV中的罕见突变。
6.3.2. Microfluidics for On-Chip Extraction and Detection
Shao等人最近开发了一种综合微流控平台，用于现场EV核酸分析，该平台集成了三个功能模块：靶向富集EVs，芯片上RNA分离，实时RNA分析。这个平台被称为免疫磁性外泌体RNA(iMER)分析平台：利用抗体功能化的磁珠从宿主来源的囊泡中分离癌症特异性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。当EV裂解液通过玻璃珠过滤器时，选择性吸附EV RNA并从过滤器中洗脱，用于反转录和qPCR分析。为了简化分析过程，所有关键部件都集成到一个芯片盒中。
随着该系统的发展，作者研究了核蛋白的两个mRNA靶标，MGMT(6-甲基鸟嘌呤)
6.3.3. Ion-Exchange Nanodetector
为了减少EV miRNA检测的样品丢失和处理时间，tall等人开发了两个系列微流控平台，一个裂解装置和一个检测装置，将总分析时间缩短到∼1.5 h，其中包括EV∼30 min的裂解和∼1 h的检测。利用交错换能器使电晶体表面产生声表面波对EV进行裂解。RNA检测则是通过离子交换纳米膜传感器完成的。该传感器由across two reservoirs的阴离子交换膜桥接组成，当电流通过膜时，阴离子通过膜，产生相应的跨膜电流电压特性(CVC)。通过捕获寡核苷酸探针使膜表面功能化，然后通过CVC的改变而敏感地定量膜表面的目标RNA。
6.3.4. LSPR-Based Assay
局域SPR (LSPR)是由于表面等离子体在大小与入射光波长相当或更小的纳米颗粒中的限制而产生的。不同于SPR，LSPR诱导的等离子激元在纳米结构上局部振荡，而不是沿着金属-介电界面振荡。因此，LSPR中的电磁场衰减得更快。这种较短的场衰减长度(<100 nm)减少了传感器对体折射率变化的干扰，提高了对表面小生物分子结合的敏感性。Joshi等人利用LSPR在检测小生物分子方面的优势，最近开发了一种使用附着在固体基质上的化学合成纳米金的敏感miRNA传感器。该传感器的制作分为两个步骤：(1)化学合成直径约40纳米的金纳米颗粒，并以共价附着在玻璃衬底上；(2)通过捕获DNA探针和聚乙二醇隔离剂对固定化纳米颗粒进行功能化处理。由于其原子平面的均匀填料以及其锋利的纳米颗粒尖端的强电磁场增强，该传感器实现了较高的检测灵敏度，检测限为91 aM。
7. CLINICAL APPLICATIONS OF EV ANALYSES
随着越来越多的证据表明EVs在细胞间通讯中具有多种代表性的生物分子和重要的功能，其临床应用得到了极大的发展。疾病来源的EV被研究以改进诊断方法。此外，它们还可以作为治疗的有效工具。
7.1. Cancer Diagnostics
肿瘤是一种复杂的结构，包括恶性细胞和周围的基质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。最近的研究表明，EVs在肿瘤微环境中促进细胞间通讯，从而调节疾病的发生、发展，并且在治疗反应方面发挥重要作用。
7.1.1. Glioblastoma Multiforme
多形性成胶质细胞瘤GBM是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤。由于侵入性脑活检的复杂性，GBM重复活检面临重大挑战。先前的研究表明，GBM将大量的癌症特异性EVs释放到血液循环中。Skog等人的早期研究发现这些囊泡可以通过血脑屏障。GBM EV被发现含有mRNA、miRNA以及血管生成蛋白。
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7.2. Neurodegenerative Diseases
在大多数神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆)中存在类似的疾病进展模型，其中错误折叠的蛋白质自结合形成有序的聚合体并在细胞中聚集。阿尔茨海默病(AD)中，淀粉样蛋白的Abeta肽的形成可能是这些蛋白聚合体中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一种类型的聚合体在细胞内形成，主要由alpha-synuclein(突触核蛋白)组成，称为路易小体。最近的研究表明，许多神经退行性疾病中涉及的错误折叠蛋白出现在EV中。因此，这些囊泡为检测和监测神经退行性疾病带来了新的希望。
AD是一种迟发性神经系统疾病：由于神经变性而导致记忆和认知能力的逐渐丧失。虽然AD的确切病因仍是一个有争议的话题，但很明显，与Aβ肽相关的斑块沉积和与tau蛋白相关的神经纤维缠结对疾病的进展是非常重要的。这些淀粉样肽来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解过程。这一过程可以发生在细胞的多个位置，特别是在调节内小泡循环的途径中，这也与EV的形成很相关。Rajendran等人确定Aβ肽被转运到多泡体(multivesicular bodies)中。在EV中发现了一小部分Aβ肽被分选到腔内囊泡并输出到细胞外。作者还发现，外泌体蛋白可在AD患者大脑斑块中积累，提示EVs在AD发病机制中发挥作用。
最近，Kapogiannis等人发现，胰岛素抵抗通路标记物也可以用于AD的检测。在AD和2型糖尿病患者中，胰岛素抵抗会导致大脑相关区域葡萄糖摄取减少。通过免疫亲和捕获法从血浆样本中富集神经EV，研究人员调查了对照组(这些患者的样本在AD诊断前1 - 10年获得)和AD患者(PC-AD)中磷酸化的丝氨酸-1型胰岛素受体底物(IRS-1)的表达。有趣的是，在EVs中可以发现该标记物，与对照样本相比IRS-1的水平在AD的临床前和AD明显症状阶段都升高了。
7.3. Acute Organ Injury
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7.4. Therapeutic Potential
EVs是生物活性物质(如蛋白质、mRNA和miRNA)的内源性载体。最近的研究表明，EV参与了物质的传递和功能信息的交换，从而调节病理生理过程，激活细胞间的远程通信。目前的EV分类主要基于囊泡的生物发生，对于囊泡中的生物活性物质与其分类之间的相关性或囊泡的亚群是否具有不同功能的了解甚少，弄清楚这些有助于更好地理解EV作为循环生物标志物的诊断潜力以及用于传递治疗的生物活性功能。
迄今为止，EVs已被直接或工程应用于多种用途的治疗剂，如再生医学、癌症治疗、和免疫调节。最近的研究发现，来自间充质干细胞的EV在心肌梗死、肾脏损伤和骨骼肌修复模型中具有有益的旁分泌作用。这种旁分泌效应依赖于通过EV向受体细胞转移生长因子、蛋白质、生物活性脂质和遗传物质，为消除干细胞直接移植的安全隐患提供了可能。
EVs也可以用于投递治疗性物质。有两种不同的方法被用于EVs基因治疗。在第一项研究中，封装在囊泡中的腺相关病毒(AAV)载体被证明在向受体细胞传递遗传物质方面比自由载体更有效且具有更少的免疫原性。在第二项研究中，通过转染的亲代细胞分泌含有自杀基因mRNA和蛋白质的囊泡。这些囊泡在正交各向异性小鼠模型(与全身前药治疗相结合)中被反复注射在神经鞘瘤肿瘤从而使肿瘤消退。
8. CONCLUSIONS AND OUTLOOK
总的来说，EV包含多种细胞成分，不仅反映母细胞，而且影响肿瘤微环境和疾病进展。因为其异质性和分子量小导致无法运用简单的方法对EV进行研究。正如本文所述，许多新的分析平台正在开发和优化，以使EV的分析比传统方法更方便和敏感。这些平台可以为新兴的EV生物学提供见解，并将EV定位为(1)一种潜在的非侵入性生物标志物，以指导个性化医疗；(2)一种新的治疗方法，用于传递内源性调节因子(如免疫激活因子)或外源性治疗(如药物和蛋白质)。
最后，我们提出了进一步改进EV测定的关键方面。首先，应建立测定校准的标准样品。与其他分析测试一样，EV测试样品对处理过程非常敏感；EV计数、类型和分子含量随收集方法、储存介质和检测本身的不同而不同。制定EV检测标准将减少由于协议差异而产生的不一致性，提高检测的重现性，并实现无偏差的跨平台比较。因此，美国国立卫生研究院正在开发一个细胞外RNA作为生物标志物的参考数据库。其次，为了建立疾病状态的可靠基准，匹配的对照样本是很重要的，因为人类生理因素(如性别和年龄)可能影响EV的产生和组成。统计分析也应该把这些因素作为与EV分子信息一起作为变量考虑进去。最后，需要开发一种单EV分析技术来阐明EV的生物发生、分子组成和多样性，类似单细胞测序的意义。大多数新的分析平台，虽然优于传统的方法，仍然需要大量的EV起始量，得到是一小群囊泡的群体表征特性。分析单个EV可以揭示细胞特异性EV的独特分子结构，这将进一步促进囊泡的创新临床应用(例如，诊断和药物载体)，并使我们能够根据不同的物理/生物参数(例如，囊泡大小、起源和细胞状态)构建一个完整的EV图谱。
