背景
feature
- 定义：基因组上对具有不同性质区域的定义 (例如：gene/exon/intron/miRNA等)。
- 优点：利于分类整理结果。
两类测序bias
- 长度bias：相同表达丰度的转录本，往往会由于其基因长度上的差异，导致测序获得的Read（Fregment）数不同。总的来说，越长的转录本，测得的Read（Fregment）数越多。
- 测序深度bias：由测序文库的不同大小而引来的差异。即同一个转录本，其测序深度越深，通过测序获得的Read（Fregment）数就越多。
- 本文提到的RPKM/FPKM/RPM等方法都是为了消除这两类bias而进行的标准化。例如：RPM主要应用于sRNA（sRNA长度变化不大），来消除测序深度bias；RPKM/FPKM应用范围会更广泛，用于同时消除长度及测序深度这两种bias。
- 下面的计算以exon为例。
1、几种丰度计算方法
reads Count
- 定义：高通量测序中比对到exon上的reads数。可使用featureCount等软件进行计算。
- 优点：可有效说明该区域是否真的有表达及真实的表达丰度。能够近似呈现真实的表达情况。有利于实验验证。
- 缺点：由于exon长度不同，难以进行不同exon丰度比较；由于测序总数不同，难以对不同测序样本间进行比较。
RPKM/FPKM
- 定义：
RPKM: Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)；
FPKM: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)
上述公式1 RPKM可从下面公式推导而出：
解释：ExonMappedReads即为比对到该exon上的reads count；ReadLength是测序的Read长度； TotalMappedReads即为比对到基因组上所有reads count的总和；ExonLength 为该Exon的长度；ReadLength可消除；GenomeLength即为基因组全长，因为是相同基因组，所以该数值也可消除。
公式4中，TotalMappedReads * ReadLength/ GenomeLength为基因组上每个碱基的测序深度，ExonMappedReads * ReadLength / ExonLength可以简单的认为是该Exon上每个碱基的“测序深度”。两者相除，就得出该Exon上每个碱基相对基因组进行标准化的'测序深度'。因一般是相同物种，基因组一般相同，且测序长度相同，所以公式4换算并消去ReadLength，GenomeLength，就成为公式1的形式了。那么因Exon长短、测序深度造成的样本间造成的偏差，都可以消除。个人认为RPKM/FPKM应当能够消除两种类型的bias。
- 优点：tophat-cufflinks流程固定，应用范围广。理论上，可弥补reads Count的缺点，消除样本间和基因间差异。
- 讨论：有人说RPKM/FPKM标准化不合理，好像说的很有道理，也没太多时间整理了。黄树嘉的描述与RPKM/FPKM的差异：他的文章主要是说一个Exon整体转录了几次？主要描述为一个Exon整体转录情况。但是公式1RPKM主要计算的是Exon上单个碱基的转录情况，一个Exon上所有碱基转录情况的均值代表了该Exon转录情况。所以RPKM/FPKM可能与真实表达情况是有偏差的，但是应该能够大致反映真实的情况。
- FPKM：与RPKM计算过程类似。只有一点差异：RPKM计算的是reads，FPKM计算的是fragments。single-end/paired-end测序数据均可计算reads count，fragments count只能通过paired-end测序数据计算。paired-end测序数据时，两端的reads比对到相同区域，且方向相反，即计数1个fragments；如果只有单端reads比对到该区域，则一个reads即计数1个fragments。所以reads count接近且小于2 *fragments count。
RPM
- 定义：RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)
- 公式：RPM = ExonMappedReads * 10^6 /TotalMappedReads
- 优点：利于进行样本间比较。根据比对到基因组上的总reads count，进行标准化。即：不论比对到基因组上的总reads count是多少，都将总reads count标准化为10^6。sRNA_seq等测序长度较短的高通量测序经常采用RPM进行标准化，因为sRNA长度差异较小，18-35 nt较多，所以长度对不同的small RNAs相互比较影响较小 (优点：计算简单、方便。)。
- 缺点：未消除exon长度造成的表达差异，难以进行样本内exon差异表达的比较。
TPM
- 定义：TPM: Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)
- 公式：
解释：Ni为比对到第i个exon的reads数； Li为第i个exon的长度；sum(N1/L1+N2/L2 + ... + Nn/Ln)为所有 (n个)exon按长度进行标准化之后数值的和。 - 计算过程：首先对每个exon计算Pi=Ni/Li，即按长度对reads count进行标准化；随后计算过程类似RPM (将Pi作为正常的ExonMappedReads，然后以RPM的公式计算TPM)。
- 优点：首先消除exon长度造成的差异，随后消除样本间测序总reads count不同造成的差异。
- 缺点：因为不是采用比对到基因组上的总reads count，所以特殊情况下不够准确。例如：某突变体对exon造成整体影响时，难以找出差异。
2、相互关系
- 评价：以上几种计算exon表达丰度的方法，差异不是非常大。如果结果是显著的，那么采用上面任一计算方法大多均可找出显著结果。但是当表达丰度差异不是那么显著时，不易区分不同类别，需要根据实际需要选择对应的标准化方法。通常情况下首先推荐FPKM值；计算样本差异时(edgeR/DESeq2等)，采用raw read count；计算sRNA丰度时，通常采用RPM值。
- 注意：以上TotalMappedReads推荐首选比对到基因组上的总reads数，而不是比对到exon或者gene上总reads数。而且需要注意可能存在某一区域产生大量序列的情况，如：rRNA/tRNA及一些未注释区域等。如果该区域可能影响最终结果，TotalMappedReads需要减去这些产生过量扩增的序列或去除重复序列（Deduplicate很多时候都是很有必要的，samtools markdup：bam文件过滤和去重复）。这同样需要根据实际情况而定。
参考：
科学网-江纯阶
简书-jlyq617
