什么是测序深度和测序覆盖度

测序深度（depth）是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值，可以理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。测序深度 = reads长度 × 比对的reads数目 / 参考序列长度。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。

测序覆盖度（coverage）是指测序获得的序列占整个基因组的比例。指的是基因组上至少被检测到1次的区域，占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。

在RNA-Seq的分析中，我们常用RPKM，FPKM和TPM作为转录组数据定量的表示方法，它们都是对表达量进行标准化的方法，RPKM, FPKM, TPM是为了消除基因长度和测序深度的影响。
在RNA-Seq的分析中，为了获得差异表达基因，只需要对不同基因的测序Read数进行比较即可。然而比对到不同基因上的Read数目并不能直接用于比较这两个基因的表达量差异，因为在RNA-seq中有一个很浅显的道理，基因越长，比对到此基因上的Read就会越多；测序深度越大，那么本次RNA-seq的所有Read数都会增加。也就是说Read数除了和基因表达量相关外，也和基因的长度、测序深度有关，因此为了比较多个RNA-seq重复（测序深度有一定差异）的不同基因（基因长度有一定差异）之间的表达量差异，那么就不能使用Read数直接进行比较，而是需要对Read数进行标准化。

以RPKM为例：

全名为：
Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads（每千个碱基的转录每百万映射读取的reads），主要用来对单端测序（single-end RNA-seq）进行定量的方法。
计算方式为：
RPKM = total exon reads / (mapped reads (Millions) * exon length(KB))；
其中，
total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；
mapped reads (Millions) ：某个样本的所有reads总和；
exon length(KB)：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）。

可以用这个公式计算基因，外显子，转录本的表达

总结一下，RPKM的计算方法：
计算总Read数：计算每一个RNA-seq样本的总Read数，然后将其换算为以百万位单位（M）；
标准化总Read数：将所有基因的Read数除以总Read数；
标准化基因长度：再将所有基因的Read数除以基因长度（基因长度单位为kb）

FPKM与RPKM

Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments（每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments），主要是针对pair-end测序表达量进行计算。

其实FPKM同RPKM是一样的，只是RPKM用于单末端测序，而FPKM用于双末端测序。
二代测序时，会将所有的DNA打成片段（fragment），然后再去测序。单末端测序时，一个片段对应一个Read，双末端测序时，一个片段会从两端分别测定一次，因此这两个配对Read对应的是同一片段（偶尔也会有一个片段只对应一个Read的情况，另一个Read因为某些原因被剔除或丢失了）。
区别也就在这里，对于FPKM来说，配对到同一片段上的两个Read只会算作一个Read，也就是说FPKM是以Fragment为准，不以Read数为准，其他计算方式是完全一样的。

TPM的计算

Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads（每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts）。
计算方式为：
TPMi = (Ni/Li) * 1000000 / sum(Ni/Li + …….. + Nm/Lm)；
Ni：mapping到基因i上的read数；
Li：基因i的外显子长度的总和。

TPM的计算方法其实同RPKM很类似，同样的对基因长度和测序深度进行标准化，只不过RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化；而TPM是先进行基因长度标准化，后进行测序深度标准化。事实证明，TPM的标准化方法更有优势。TPM可以用于同一物种不同组织间的比较，因为sum值总是唯一的。

总结一下，TPM的计算方法：
标准化基因长度：将所有基因的Read数除以基因长度（基因长度单位为kb）；
计算总Read数：计算每一个样本的总Read数，然后将其换算为以百万位单位（M）；
标准化总Read数：将所有基因的Read数除以总Read数。

RPM/CPM

Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)

CPM的计算公式：
CPM = total exon reads / mapped reads (Millions)

参考：
https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzUzMTEwODk0Ng==&mid=2247484190&idx=1&sn=e85f0e0899ad268745a481d2c82fba23&scene=21#wechat_redirect
https://www.jianshu.com/p/1940c5954c81