DNA methylation predicts the outcome of COVID-19 patients with acute respiratory distress syndrome
DNA甲基化可预测COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者的结局
发表期刊：J Transl Med
发表日期：2022 Nov 12
影响因子：8.440
DOI: 10.1186/s12967-022-03737-5
一、研究背景
COVID-19是一种新型冠状病毒，于2019年底在中国武汉首次发现，2020年3月被世界卫生组织（WHO）宣布为大流行病。两年后，检测到几个变种，有超过500万例死亡记录。严重的COVID-19感染患者常常出现呼吸衰竭，可能需要机械通气，与高达50%的死亡率有关。已经确定了危重病人结局的几个预测因素。它们主要包括临床变量、生化标志物和并发症。感染期间，宿主细胞的DNA甲基化可以被改变，从而调节免疫反应。
表观遗传学指的是研究不依赖DNA序列的基因活动调节和表达变化。DNA甲基化是表观遗传学的标志之一，涉及到在胞嘧啶环的5′碳上共价添加一个甲基。甲基化与基因表达呈反比关系。
二、材料与方法
1、数据来源
在四个时间点（T）进行随访：第7天（T2）、第14天（T3）、第21天（T4）和第60天（后T4）
2、分析流程
1） PBMCs分离和DNA提取
2） EPIC850甲基化质量控制、数据过滤和归一化
3） 免疫细胞种群的估计：R中的FlowSorted Blood EPIC包被用来估计来自归一化甲基化数据的细胞类型组成，包括T淋巴细胞（CD4 +和CD8 +）、B细胞（CD19 +）和单核细胞（CD14 +）、NK细胞（CD56 +）以及中性粒细胞；使用R中broom包中的lm和glance函数，确定了确定免疫细胞比例之间差异的准确模型
4） 甲基化分析和组间比较
5） 预测结果：对CpGs进行单变量Cox比例风险分析，以确定与患者生存有关的甲基化位点；使用R中的生存包，用K-M分析来估计两组基因的生存差异，通过cox比例风险模型来估计两组之间的差异；使用pROC软件包对甲基化被用于预测生存的逻辑回归模型进行ROC分析
三、实验结果
01 - 入院时COVID-19患者与对照组之间的甲基化差异
作者首先进行了PCA分析，以确定数据集中是否存在人群分层的情况。主成分1（PC1）解释了13.5%的变异。相比之下，PCA 2解释了9.3%的变异，没有观察到与COVID-19或对照组参与者或种族有关的人群结构化。
在COVID-19中，免疫细胞的比例经常是可变的；因此，进行去卷积法，根据过滤和归一化的数据估计每个样本中免疫细胞的比例。使用线性模型，随后寻找在组间有明显差异的细胞比例。基于AIC的最佳模型，CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞在COVID-19患者和对照组之间存在明显差异。与对照组相比，COVID-19患者的CD8和CD4 T细胞明显降低，B细胞明显升高（图2A）。
为了研究CpG甲基化水平的变化是否与COVID-19感染有关，首先通过测试临床协变量和免疫细胞比例，建立了最佳线性模型。共测试了11个不同的模型，根据AIC标准，三种免疫细胞类型（CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞）比例对CpGs的数量贡献最大；因此，它们被纳入差异甲基化分析的最终模型。与对照组相比，在COVID-19患者中检测到33.3%的差异甲基化CpG（750874中共有133335个；71527个低甲基化，61808个高甲基化）（图3）。基因相关的不同甲基化CpGs占0.7%（1054/133335），而启动子相关的CpGs更为丰富，占14.4%（19238/133335），表明其在基因调控中的潜在作用。观察到的甲基化变化与20822个独特的基因有关。
为了确定分析的可重复性，作者将观察结果与以前发表的数据进行了比较（图4）。首先，调查了以前在预测COVID-19严重程度方面显示出极大准确性的44个CpG位点在COVID-19和对照组之间是否存在差异。代表6个基因的9个CpG，包括IFI44L（cg13452062）、DDO（cg02872426）、SGMS1（cg10188795）、CXCR2（cg19225688）、CCDC6（cg04736673）、CDC42BPB（cg02003183）、cg06601098、cg11671940和cg18523915也在本研究中被差异甲基化。此外，在相同的基因中发现了不同的甲基化CpG，但与Castro de Moura等人的研究报告中的位点不同，这些基因包括：AIM2和HLA-C基因中的两个CpG，以及以下每个基因中的一个CpG位点：CELF4, CEP85L, KIFAP3, LCE1C, LHX6, MOBKL2A, PM20D1, PM20D1, SORCS1, UBAP2L, UBE2W, VIM, ZNF385D。
此外，作者检查了以前报道的COVID-19相关的基因是否有明显的CpG甲基化变化。在Castro de Moura等人报道并在其他研究中重复的40个基因中，在COVID-19患者的39个基因中检测到220个CpG，107个超甲基化，113个低甲基化（图3、4）。这些基因包括免疫反应、病毒进入、病毒复制、血液凝固、肺细胞中的蛋白质结合、泛素连接酶和ACE2相关基因。作者进一步进行路径富集分析，以测试显著甲基化的CpGs之间的关系。发现免疫相关途径的明显富集，包括干扰素-γ和干扰素-α反应、早期雌激素反应、顶端表面和紫外线反应。这些途径在COVID-19患者中出现低甲基化，表明许多免疫相关基因可能被诱导表达。有丝分裂纺锤体途径是COVID-19患者中唯一的高甲基化途径。
还使用与CpGs相同的模型进行了差异甲基化区域（DMR）分析，其中在COVID-19患者中发现了4788个低甲基化，包含≥5个CpGs的簇，跨越5723个基因。还检测到总共4347个低甲基化区域，覆盖5072个基因，表明DMRs横跨一个以上的基因。为了确定DMR分析检测到的基因之间的关系，进行了通路富集分析。作者发现干扰素-α反应和Kras信号通路在COVID-19中低甲基化的明显富集。相反，有丝分裂纺锤体途径超甲基化，显示出与单个CpG分析的相似性。
3名COVID-19患者在T2时死亡，5名在T3时死亡，4名在T4时死亡，12名在T4后死亡，即60天内最初纳入的100名患者中有24名死亡（24%）。死亡的病人平均比康复的病人大11岁。正如预期的那样，他们有更多的鼻腔感染，更有可能接受体外膜氧合（ECMO）。但是他们并没有患更多的心血管疾病。
02 - COVID-19组中基线和最后记录的时间点之间DNA甲基化变化的相互比较
作者比较了纳入时的免疫细胞含量和甲基化特征与死亡或康复前最后记录的甲基化特征。在恢复期，与他们的基线免疫细胞含量相比，检测到更高比例的CD4 T细胞和更低比例的中性粒细胞（图2B）。此外，确定了11989个低甲基化和22082个高甲基化的CpGs（图5A），涉及到多个途径。高甲基化的CpGs在炎症反应、干扰素-α反应、血红素代谢、通过NF-kB的TNF-alfa信号传导、雌激素早期反应、Kras信号传导、uv反应dn、il2 stat5信号传导、有丝分裂主轴、干扰素-gamma反应、IL6 jak stat3信号传导、顶端连接和成肌途径中富集。低甲基化的CpGs在异体移植排斥、有丝分裂纺锤体和myc靶点v1途径中富集。在死亡的病人中，基线和死亡前最后记录的时间点之间的免疫细胞比例没有差异（图3）。令人惊讶的是，与在那些康复的患者中观察到的变化相比，这些患者表达的差异性甲基化变化的数量比他们的基线值少。检测到3150个低甲基化和3652个高甲基化的CpGs（图5B）。经FDR校正后，与这些甲基化变化相关的途径没有明显变化。
作者还进行了DMR分析，考虑了有五个或更多CpGs的区域。在康复的病人中，有310个相对于363个基因的高甲基化区域和82个相对于102个基因的低甲基化区域。在FDR校正后，没有明显的路径。然而，一些与免疫有关的、在单个CpGs分析中具有显著性的路径也显示出DMR意义。还测试了是否有DMRs与死亡明显相关，确定了35个区域，包括45个基因，在死亡的病人中被高甲基化。在同一对比中，只有三个区域是低甲基化的，它们跨越了四个基因（即GNAS、MEST、RP1-309F20.3）。尽管如此，没有发现与这些DMR变化有关的重要途径。
03 - 两组之间在纳入和随访结束时的DNA甲基化差异的内部比较
作者比较了死亡的COVID-19患者和恢复到基线水平的患者。首先测试了模型，包括临床协变量的不同组合，以确定比较免疫细胞比例差异的最佳模型。根据这一标准，不含协变量的模型（mod7；细胞比例~死亡/恢复）被选为最佳模型，并被用于数据分析。没有发现 "死亡 "和"恢复 "患者在基线或最后一个时间点的免疫细胞有明显的差异。接下来通过测试不同的协变量，建立了这些组的差异化甲基化比较的最佳模型。模型 "none"（没有任何协变量）根据两个标准适合大多数的CpGs，因此这个模型被选为后续分析。
CpG位点或区域表明，基线（基线死亡与基线恢复）的甲基化变化对结果没有明显影响。然而，在最后一个时间点比较相同的病人，结果是死亡的病人与康复的病人相比，有1478个低甲基化和1557个高甲基化的CpG（图5C）。此外，在190个基因附近的156个区域发现了高甲基化的DMRs，在133个基因中发现了102个低甲基化的区域。没有基于DMR途径的基因的重要途径，在这个比较中，也没有发现任何免疫细胞比例的差异。
Castro de Moura等人发表的研究预测了严重的COVID-19病例的44个CpGs，与之相比，作者发现有5个CpGs仅在康复的病人的基线和最后的时间点之间存在差异。没有一个在死亡的病人和他们的基线之间有差异（图4）。四个CpG（cg11671940；RP11-351M16.3，cg10188795；SGMS1，cg17515347和cg24145401；AIM2）与基线相比是高甲基化的，一个是低甲基化的（cg06601098），它不属于任何基因区域。在Castro de Moura等人的严重COVID-19病例中，除了一个CpG是低甲基化的，其他都是低甲基化的。它们在康复的病人中都有明显的高甲基化，表明它们有可能改善结果。在Castro de Moura等人的研究中，cg06601098是一个例外，它在康复的严重COVID-19患者中被低甲基化。然而，在比较康复患者与死亡患者的最后一个时间点时，这些变化都不明显。
此外，还从以前的研究中发现了40个候选基因的CpGs变化。在此，观察到康复者在最后一个时间点与基线相比，有29个高甲基化和31个低甲基化的CpGs（图6）。死亡的病人有7个高甲基化和8个低甲基化的CpG。其中一个CpGs（TMPRSS2基因中的cg16371860）在康复者和死亡者中都有明显的低甲基化；因此，作为康复的潜在标志物，它可能没有多大意义。将最后一个时间点的康复者和死亡者与已发表的数据进行比较，没有发现Castro de Moura等人的任何重要CpG。然而，作者从40个候选基因中发现了9个CpGs，包括死亡患者中两个低甲基化的CpGs（启动子相关的OAS1；cg18217049，和TMPRSS2；cg19020860）。还看到死亡患者中有三个高甲基化的CpGs，来自STAT3（cg17833746，cg24312520，cg24718015），一个来自OAS2（cg19371652），一个来自LZTFL1（cg09709426），还有一个是来自TBK1基因（cg13540592）（图6）。
04 - 关键的COVID-19疾病诱发的差异性甲基化的时间过程
为了确定甲基化随时间的变化，作者分析了所有四个时间点的死亡或在第60天（T4后）康复的患者。首先，研究了死亡和康复的病人在免疫细胞动态方面是否有差异。使用样条函数的免疫细胞比例分析确定了中性粒细胞的显著变化，中性粒细胞在后来死亡的病人中显示出T3和T4的突然增加。相反，那些康复的患者则表现出相反的情况（图7A），表明这些细胞在临床结果中的关键重要性。
作者发现在49个CpG位点上，死亡的患者和康复的患者在四个时间点上的甲基化趋势存在差异，这些位点对应于27个基因（图8），其中大部分已知是调节蛋白结合的活性。在这27个基因中，19个已经在COVID-19中报道过，要么是病毒进入和与受体结合，要么是临床预测，如疾病的严重程度或其与末端器官损伤的关系。
在COVID-19中没有报道的基因中，有两个已知在免疫系统中起作用：DEFB116和DEFB115。这些基因属于β-防御素系统，它是先天免疫反应的重要组成部分，在保护免受感染方面发挥着重要作用。作者发现这些基因的CpGs在所有四个时间点上有不同的甲基化（图7B和C）。DEFB115在死亡的COVID-19患者中总体上甲基化程度较低，这表明在关键的COVID-19患者中表达可能增加。DEF116只在死亡的病人中出现低甲基化。
05 - 对疾病结果的预测
作者测试了COVID-19两组基线和结果前最后记录的时间点之间的相互比较、两组纳入时和随访结束时的内部比较所发出的所有CpGs（共40,956个），以及从差异甲基化的时间过程发出的CpGs。共有13个CpGs对应于8个基因预测了结果，其中三个基因是通过比较存活患者的基线和最后一个时间点的甲基化变化发出的（PSMB9、MFHAS1和MRPS2），五个基因是通过比较死亡患者的基线和最后一个时间点发出的（MAT2B、YY1P2、ROCK1、ZNF789、H1F0）。
ROC1、ZNF789和H1F0的甲基化程度较高，增加了死亡风险（图9），而PSMB9、MFHAS1、MRPS2、MAT2B和YY1P2的高甲基化会降低其风险（图10）。该模型的敏感性和特异性的ROC曲线显示，ZNF789（80.6%）和MRPS2（80%）的预测结果非常好，PSMB9（78.5%）、MFHAS（75.7%）、H1F0（75.8%）、YY1P2（72%）和ROCK1（77.7%）基因的预测结果较好，而MAT2B（66.9%）则一般（图9和10）。这些基因大多与炎症或DNA调节有关，有趣的是，这些基因中有7个在以前的COVID-19研究中被报道过。进一步，查看了SRTING数据库，以评估这些基因的蛋白质相互作用。同时，在降低死亡率的五个基因中不存在相互作用，在Reactome途径中存在富集，被称为 "凋亡执行途径"。
四、结论
总的来说，作者在重症COVID-19患者的ARDS中发现了一个预测临床结果的表观遗传特征。虽然免疫相关的途径，干扰素-α和-γ，最初是区分重症COVID-19的主要生物机制，但由八个基因组成的表观遗传学特征集预测了生存率。需要进一步的研究来阐明甲基组作为疾病生物标志物的潜在用途，最重要的是评估DNA甲基转移酶、核苷抑制剂或其他药物潜在的表观遗传学靶向疗法在COVID-19中的应用。
