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Longitudinal Multi-omics Analyses Identify Responses of Megakaryocytes, Erythroid Cells, and Plasmablasts as Hallmarks of Severe COVID-19

影响因子： 22.553PMID：33296687

期刊年卷：<u>Immunity</u> 2020 12 15;53(6) <u><u>医学一区 免疫学 Q1 4/155</u></u>

DOI：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.11.017

思路

这篇文章主要是单细胞组学与其他组学的联合应用探索COVID-19患者细胞特征的全面纵向视图的免疫状态。

1. 使用14名患者的两中心队列进行了纵向多组学研究，分析了从最多5个时间点采集的外周血样本的整体转录组，整体DNA甲基化组和单细胞转录组（> 358,000个细胞，包括BCR谱）。
2. 在两个独立的COVID-19患者队列中进行了验证。SARS-CoV2感染引起血液循环细胞动态变化，重症的COVID-19的特征是增殖性代谢活跃的浆母细胞增加。
3. 与重症疾病同时发生，作者还发现了干扰素激活的循环巨核细胞的扩增和红细胞生成增加，****并具有缺氧信号传导的特征。
4. 巨核细胞和红细胞衍生的共表达模块可预测致命疾病的预后，细胞类型特异性表达基因与致命的COVID-19结果相关。
5. 这项研究证明了SARS-CoV-2感染具有广泛的细胞作用，并为开发COVID-19患者的生物标志物和靶向治疗提供了切入点。

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重症COVID-19与机能障碍的免疫反应有关

1. 重症COVID-19患者的血浆中多种细胞因子和趋化因子的血浆含量更高（Chen等，2020 ; Giamarellos-Bourboulis等，2020 ; Huang等，2020 ; Ong等，2020）重症的情况。重症COVID-19的患者表现出I型干扰素（IFN）应答受损，IFN生成低以及IFN刺激基因的异质调节（Blanco-Melo等，2020 ; Hadjadj等，2020）。

2. 患有重症COVID-19的患者的外周血表现出分泌白介素6（IL-6）的CD14 ^hi CD16 ^hi单核细胞的高频率以及非经典（CD14 ^lo CD16 ^hi）单核细胞的减少（Hadjadj等， 2020 ; Schulte-Schrepping等，2020）。

3. 高炎症性COVID-19与增生的I-IFN激活的CD14 ⁺ HLA ^lo抑制性单核细胞的出现和中性粒细胞前期计数升高的紧急粒细胞生成有关。T细胞淋巴细胞减少和耗竭也被认为是重症COVID-19的标志（Diao等，2020 ; Giamarellos-Bourboulis等，2020; Guan et al。，2020 ; Huang等，2020 ; Zheng等，2020）。

4. SARS-CoV-2感染可引起特定的T细胞和B细胞反应（Braun等人，2020年；Grifoni等人，2020年；Long等人，2020年；Ni等人，2020年）。免疫细胞群和功能的这些变化与疾病结果持久免疫的关系如何是积极研究的领域。

5. 肺栓塞和血栓形成是重症COVID-19病例的常见临床特征（Deshpande，2020），尽管有足够的抗凝治疗。肺泡毛细血管血栓在COVID-19中的流行度是流感尸检中的9倍（Lax等，2020）。患者表现出升高的D-二聚体水平和广泛的血栓形成性微血管损伤（De Voeght等，2020；Rapkiewicz等，2020）。多项研究表明，血小板免疫细胞相互作用发生了改变（Leppkes等，2020；Manne等，2020），并且受影响的肺中存在巨核细胞（MK）（Meyerholz和McCray，2020年）。

结果

1. 研究设计

14个住院的COVID-19患者的5个外周血样本，作者采用了scRNA-seq（10x Genomics），单细胞B细胞受体（BCR），RNA-seq、DNA甲基化分析和多重细胞因子ELISA分析（图1A）。作者使用了经过修改的WHO序数量表（WHO，2020年），该量表还考虑了几种炎症标志物（血清C反应蛋白[CRP]，血清IL-6和铁蛋白）（表S2）, 该分数用于对患者的病程进行分类（图1B和1C）。

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图1用于疾病轨迹分析的疾病阶段的临床定义

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图S1

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图S2

2. scRNA-seq分析可确定沿COVID-19疾病轨迹的细胞变化

1. 358,930个细胞的scRNA-seq数据，每个样品平均有10,900个细胞（图2 A）。
2. 每位患者最多分析四个样品。UMAP用于可视化细胞种群的结构（图2 B–2E）。
3. 基于图的聚类确定了数据集中的37个不同的细胞簇（图S1 A）。根据每个簇的基因基因进行细胞类型分类，并使用参考转录组进行确认（Aran等，2019 ; Wilk等，2020 ; Zheng等，2017）（图2 B，2C，S1B和S1C）。
4. 单个患者的细胞均匀分布在UMAP表示中，但单核细胞亚群中个体间的异质性较高（图2 D，2E和S2）。
5. 跨时间点的计数揭示了几种细胞类型的变化，包括单核细胞，增生性淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞（图2 E，2F和S1 D）。
6. 作者观察到经典CD14 ⁺单核细胞的增加，尤其是在恢复期，而非经典CD16 ⁺单核细胞的数量在拟时序2和3都增加了（图S2）。
7. 此外，作者确认了在关键阶段（拟时序2）抑制了人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）的表达（Schulte-Schrepping等人，2020年）。存在CD4 ⁺细胞的淋巴细胞减少，但不如其他数据集中明显。
8. 作者还注意到，从增生阶段到早期恢复期，成浆细胞（PB）的比例增加，而B细胞在增生阶段和复杂阶段却被消耗掉了（Wilk et al 2020）。值得注意的是，作者认识到COVID-19患者外周血中几种源自骨髓的前体细胞类型的存在增加。
9. 在整个疾病过程中，MK比例明显升高（图2F）。
10. 为了定义可能直接被SARS-CoV-2感染的潜在细胞群，作者专门询问了数据集中的ACE2 mRNA量，该量在所有细胞群中均低于检测极限（<7个读数)。
11. 相对细胞比例与临床活性参数和多重血清ELISA的相关性分析表明，PB比例与血清坏死因子（TNF），IL-10和IL-21（B细胞关键参与因子）的血清量相关。通过STAT3和BLIMP-1（也称为PRDM1）分化为PB（Ozaki等，2004）。
12. 骨髓前体细胞增加与IL-33的含量增加有关，IL-33是参与调节造血干细胞再生的Th2细胞因子（Kim等人，2014年），MK升高与炎性参数升高有关，例如血清CRP，IL -6和IFN-α（图2 G）。

在细胞簇之间表现出0.25倍的差异。根据标记基因鉴定了感兴趣的簇（图S1 C）；

单核细胞（CD14，ITGAM， S100A8和A100A9），

粒细胞（FCGR3B），

类红细胞（HBA1，HBA2和HBB），

NK细胞（GNLY，NCAM1），

增殖淋巴细胞（MKI67和TUBA1B），

CD4 ⁺ T细胞（CD3G，CD4和CCR7），

CD8 ⁺T细胞（CD3G和CD8A），

树突状细胞（PLD4，IL3RA和LILRA4），

B细胞（CD19），

浆母细胞（CD27，CD38和MZB1），

巨核细胞（ITGA2B，TUBB1和GP9）和前体细胞（CD34，ITGA4和TUBA1A）），

例如造血干细胞（HSC），巨核细胞-红系祖细胞（MEP），常见髓样祖细胞（CMP）和

粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）。

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图2沿COVID-19疾病轨迹的细胞变化

（A）原理图工作流程。

（B）所有合并样本的细胞类型UMAP表示。通过簇基因基因鉴定了十二种细胞类型。总共描绘了358,930个细胞。

（C）细胞类型特异性特征基因的点图。根据十个最具特征的基因的表达量选择基因。颜色区分具有增加的（红色）表达或减少的（蓝色）表达的基因，点大小代表每组表达相应基因的细胞数。

（D）所有合并样本的原始UMAP样本表示。样品使细胞着色。样本命名基于患者ID（001-014）和样本采集时间的第1天（入院后TA），第3天（TA2），第8天（TB），第11天（TB2），第14天（TC），和第20天（TE）。

（E）所有合并样本的伪时UMAP表示，用伪时上色。

（F）按拟时序分组的单元比例。表示为点的细胞比例是指基于单个样品的总细胞数的百分比，水平线表示平均值。拟时序由颜色表示。p值基于纵向线性混合模型，用于COVID-19拟时序的比较，p值基于Mann-Whitney检验，用于健康与COVID-19样本之间的比较。

（G）常规测试和多重ELISA中包括的细胞特异性比例与临床参数之间的相关热图。

斯皮尔曼相关性的^∗ p <0.05，^∗∗ p <0.01和^∗∗∗ p <0.001。颜色强度对应于相关系数。

缩写如下：DC，树突状细胞；树突状细胞。PB，PBs；MK，巨核细胞；HSC，造血干细胞；MEP，巨核细胞-红系祖细胞；CMP，普通骨髓祖细胞；GMP，粒细胞-单核祖细胞。

3. 全血转录组特征沿COVID-19疾病轨迹动态变化

1. 作者接下来分析了13个住院患者的全血转录组学数据，从最多5个时间点开始与恢复对照进行比较，并将特征与14个健康对照进行比较（图3 A）。
2. 主成分分析显示，健康对照组和COVID-19患者之间在第一主成分（PC1）上存在分离（图3 B）。
3. 在健康对照和COVID-19患者之间，在对照与每种疾病轨迹假时的成对比较中，共有5,915个基因差异表达（图3 C和S3I）。与健康对照组相比，COVID-19患者中大多数差异表达基因（DEG）的表达水平更高（图3 C和S3 A）。早期变化包括免疫球蛋白转录本（IGHA1和IGHG1）和乳铁蛋白（LTF）的增加，而编码Th17特异性转录因子（TF）和II类HLA转录本的RORC mRNA水平在整个病程中均下降。
4. ImpulseDE2来构建DEG的个体内部随时间变化的模型（Sander等人，2017年）。作者确定了935个DEG，它们遵循整个疾病轨迹的脉冲状进展模式（图3 D和S3一种）。
5. IL-1β和血管舒张信号转导相关的基因在增量轨迹中（拟时序1）高表达。从逐渐恢复到晚期恢复期（拟时序1、3和4），编码核糖体结构蛋白的转录物大量减少，这可能反映了I型干扰素对蛋白合成装置的普遍抑制（Jiang等， 1997）。相反，在疾病活动高峰期，与IFN相关的转录产物显著增加，但是在关键疾病类别中却受到抑制（图3 D和S3 B），证实了较早的报道（Blanco-Melo等， 2020年；Hadjadj等人，2020年）。涉及髓样细胞介导的免疫和嗜中性粒细胞脱粒的转录本在拟时序1、3和4期间适度增加，但在关键拟时序2期间则显著增加。值得注意的是，在后期恢复期（拟时序5和6），强烈的红系信号可检测到细胞分化（例如HBD，OPTN和FIS1），表明对缺氧有反应（Ashrafi和Schwarz，2013年）。
6. 作者使用基因组资源DoRothEA通过丰富的调节子分析来推断转录因子（TF）活性。活动性疾病中的TF与炎症和IFN信号传导（例如IRF1和STAT3）以及低氧信号传导（HIF1A）有关（图S3 C）。支持在单细胞分析的第一部分中确定的IL-21-PB轴，据预测PRDM1（由BLIMP-1编码）在关键和恢复时间点均具有显著活性。对REACTOME数据库进行的所有活动TF的超几何测试显示，“细胞分化途径”（q = 0.03）和“ MK发育与血小板生成”（q = 0.05）丰富。
7. 通过使用有符号和有方向的蛋白质-蛋白质相互作用，利用上游网络拓扑结构进行基因表达改变（Liu等人，2019年），作者可以证明MAPK3（也称为ERK1）和MAPK1（也称为ERK2）在所有拟时序中具有最高的中心性（图S3 D）。
8. 作者使用各自的DEG进一步构建了每个假时的代谢模型（Gebauer等人，2016），发现与康复和健康个体相比，炎性疾病状态与更高数量的预测代谢活性途径相关（图S3 E）。作者还调查了大量RNA数据集是否存在病毒读取，并且未在任何样品中检测到相关量（> 10）的病毒读取。阴性常规实时PCR（E基因和S基因扩增子）也证实了这一发现（数据未显示）。

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图3COVID-19中全血基因表达的动力学

（A）原理图工作流程。

（B）基于所有基因的表达的所有对照和COVID-19样品的PCA图。样本通过其拟时序进行颜色编码，并通过患者或个人ID进行标记。

（C）记录控件与每个COVID-19拟时序（x轴）之间DEG的₂倍变化（y轴）。颜色区分具有增加的（红色）或减少的（蓝色）表达的基因，并且点大小代表统计显著性（调整后的p值）。点的透明度表示基因显著差异表达的比较次数。表达增加和减少的基因数量分别写在图的顶部和底部。

（D）跨COVID-19拟时序（拟时序1、3、4、5和6）的前500个纵向DEG的热图。显示了对照和拟时序2中的基因表达，分别用于在热图的左端和右端进行比较。归一化计数的逐行z分数绘制在热图中。通过使用它们的邻接得分作为距离，将基因按层次进行聚类。

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图S3

4. 纵向共表达模块可确定关键疾病中干扰素应答的受损以及血栓和红细胞生成增加的特征

1. 作者使用从成对和纵向分析（6,317个基因）的组合中识别出的所有DEG进行加权基因共表达网络分析（Langfelder和Horvath，2008；Lee等，2004）。分析确定了共10个共表达基因的模块，作者称之为M1-M10，它们在整个COVID-19疾病阶段遵循不同的表达方式（图4 A和S3 F；表S3）。
2. 作者评估模块与scRNA-seq衍生的细胞组成（图4 B）和临床参数（图4）之间的个体相关性C）。在scRNA-seq数据上预测每个模块的中枢基因的表达，揭示了细胞类型和拟时序特异性表达模式（图S4）。基因集富集分析揭示了每个模块中富集的生物学过程和途径。
3. 转录因子结合位点（TFBS）推论（Breuer等，2013）被用来描述推定的TF。M2代表I型IFN反应和增殖活性（G2M过渡）的特征（图4 D），并且富含IRF1，STAT1和STAT2的结合位点（图S3G）。
4. M4与外周血以及D-二聚体中MK的存在有关，并且具有两个表达峰，分别在临界状态（拟时序2）和早期恢复期（拟时序4）。
5. M7包含与血红蛋白生物合成有关的转录本，并与GATA-1和GATA-2的TFBS基序重合，这是与类红细胞分化相关的TF（图S3 G）。这种双相性模式可能与高度急性炎症期间的缺氧（第一个峰值）和恢复期中断补充氧气（第二个峰值）有关。

总而言之，对患者全血中时间基因表达模式的分析清楚地描绘了沿着理想疾病轨迹发生的SARS-CoV-2病毒感染的病理生理结果。

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图4差异表达基因的共表达分析和甲基化变化的整合

（A）通过使用所有成对的和纵向的DEG构建的共表达模块的组本征基因热图。绘制每个拟时序内所有样本的平均特征值。基因的数量以条形图的形式绘制（右图）。

（B）相关热图显示了基因共表达模块（行）与来自scRNA-seq数据（列）的细胞特异性比例之间的Spearman秩相关系数。斯皮尔曼相关性的^∗ p <0.05，^∗∗ p <0.01和^∗∗∗ p <0.001。颜色强度对应于相关系数。

（C）相关热图显示基因共表达模块（行）与临床参数（列）之间的Spearman秩相关系数。斯皮尔曼相关性的^∗ p <0.05，^∗∗ p <0.01和^∗∗∗ p <0.001。颜色强度对应于相关系数。

（D）点图显示了针对GO（生物过程），Hallmark和《京都议定书》的基因和基因组百科全书（KEGG）基因集的基因共表达模块的基因集富集分析（GSEA）。点的大小与归一化的富集得分（NES）成正比，颜色对应于错误发现率（FDR）。所选的热门术语将可视化。

（E）对全血EPIC阵列数据进行的分析及其与大量RNA-seq数据的集成的示意性工作流程。

（F）控件与每个COVID-19拟时序之间显著DMP的数量。与来自对照的颜色相比，颜色区分了COVID-19样品中的甲基化过高的位置（红色）和甲基化过低的位置（蓝色）。

（G）每个拟时序前30,000个DMP之间的DMP比较。垂直条形图指示在时间点（右侧）之间共享的特定DMP的数量（左侧），这些点表示为连接的点（底部）。仅显示选定的重叠。

（H）热图显示了在不同COVID-19拟时序鉴定出的DMP中，TFBS在TFBS中的显著富集（通过比值比量化）。

（I）点图显示富含DMP-DEG对的GO项。点的大小与基因比例成正比，颜色对应于富集的p值。

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图S4

5. 全血DNA甲基化分析揭示了与基因表达相关的COVID-19中的全基因组低甲基化

1. 作者研究了DNA甲基化（DNAM）沿COVID-19疾病模式当然下列中描述的工作流程。图4E中相同的患者的一个子集（n = 6）（表S1）和具有六个健康年龄的人群相比，它们和性别匹配的控件。
2. 与健康对照进行成对比较，并在拟时序之间鉴定出46,071和69,733个差异甲基化的CpG位点（图4 F，4G和S5 B）。与健康对照相比，每个时间点都存在大量的低甲基化位点。细胞反卷积分析（Müller,2019）鉴定出与COVID-19相关的DNAm基因的主要部分来自粒细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞（图S5 A）。
3. 使用基因座重叠分析推断差异甲基化的TF结合位点（Sheffield和Bock，2016年），作者观察到CCAAT增强剂结合蛋白Beta（CEBPB）在低甲基化区域中的结合位点显著过量表达（图4 H），这一点非常关键紧急粒细胞生成的作用（Hirai等，2006）和B淋巴细胞向粒细胞的转分化，这一过程已在重症的COVID-19中提出（Wilk等，2020）。
4. 作者采用了分层测试方法（Pan等人，2018）来鉴定转录组和顺式DNAm基因之间的相互作用（图4 E）。为此，作者在所有DEG（组合组）的相应转录起始位点上下游的5 kb窗口内筛选了差异甲基化位置（DMP）。在所有3,280个DMP-DEG对中，有68.3％的人显示出增加的表达而甲基化程度降低或表达的减少而增加了甲基化程度，这与之前的研究一致（Häsler等人，2012）。
5. 接下来，作者研究了共表达模块M1-M10中DMP-DEG对的表示。基于等级的相关性分析确定了所有模块中的DMP-DEG对，并且在M3和M8中存在明显的过剩现象（图S5 C和S5D）。
6. DMP-DEG对的基因本体（GO）术语富集分析表明，DEG中固有免疫相关术语的富集具有增加的表达（例如TNF和IL-6信号转导和Toll样受体[TLR]途径），并且还鉴定了与血小板功能和代谢过程（ATP代谢和自噬）有关的基因集（图4I）。
7. 将DMP-DEG对基因在发炎期增加（拟时序1-4）或在后期恢复期减少（拟时序5和6），将其映射到scRNA-seq数据，鉴定出较大的细胞类型特异性DMP-簇PB，单核细胞和MK的DEG对（图S5 E和S5F）。

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图S5

6. 整个COVID-19疾病轨迹的成浆细胞和B细胞变化

1. 鉴于作者的发现指向了沿COVID-19疾病轨迹变化的B细胞群，作者接下来将更详细地研究B细胞谱系（图5 A）。
2. 作者首先从队列1的scRNA-seq数据中提取了22190个细胞，并将其识别为B细胞谱系的一部分。UMAP嵌入识别出两个反映真实B细胞的不同大簇，其中包括11509个记忆B细胞，3993个幼稚B细胞，383个过渡性B细胞。和6,295 PB细胞（图5 B）。
3. 在COVID-19期间，PB在很大程度上处于扩张状态，在高炎症期处于最高水平（图5 C）。
4. 多色流式细胞证实大量循环CD27的^喜CD20 ^-在CD19的级分的细胞⁺细胞，随着疾病的恢复而下降。同样地，幼稚（CD20的早期相对降低⁺ CD27 ^- ）和记忆B细胞（CD20 ⁺ CD27 ⁺）达到在归一化后的时间点（图5 D）。
5. 作者还发现炎症阶段（假时1-4）中有很大一部分HLA-DR ⁺ CD138 ⁺双阳性PBs。而CD138 ⁺细胞仅在活动性疾病丰富而不是在恢复期，82％-98所有CD27的％^喜CD20 ^-细胞保持HLA-DR ⁺（图S6F）。
6. 值得注意的是，由于PB对操作非常敏感，因此作者认识到，与流式细胞仪数据相比，针对scRNA-seq（也适用于队列2）的处理程序减少了完整PB的数量，而保留了PB数量增加的纵向动态两种方法之间。
7. 作者可以区分出较小的PB簇，这些PB簇表达与嗜中性粒细胞相关的基因（例如ELANE，MPO和CAMP）（图5 E）。与之前的研究不同（Wilk等，2020），作者还在健康受试者中发现了这种细胞，尽管频率较低（图5 C）。（使用monocle3 。Qiu等人，2017），作者强调过渡B细胞的细胞轨迹成幼稚和记忆B细胞，与单独的记忆B细胞簇是最有可能的CD45RB ^-细胞（Glass等人，2020, 图5F）。作者可以追溯PB的进展，PB的进展不是基于免疫球蛋白类别而是基于疾病状态，而来自高炎症期的细胞则与轨迹的根部距离更远（图S6 A和S6B）。中性粒细胞样PB细胞未连续链接到PB轨迹（图5 F）。

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图5B细胞分析可确定整个COVID-19疾病轨迹的成浆细胞变化

（A）原理图工作流程。

（B）以UMAP表示的B细胞群亚型。总共描绘了22,190个细胞。记忆B细胞（MB）（深红色），幼稚B细胞（N）（红色），过渡性B细胞（反式）（橙色）和成浆细胞（PB）（蓝色）。

（C）B细胞群拟时序表示为UMAP。

（D）B细胞亚型的流式细胞仪分析。CD19 ⁺ B细胞的CD20和CD27染色。CD20 ^- CD27^高列为PB B细胞，CD20 ⁺ CD27 ⁺细胞作为MB，和CD20 ⁺ CD27 ^-细胞作为CD19中的每个细胞类型的比例N. ⁺ B细胞是相对于所述疾病发作，由相应pseudotime着色，和由患者连接。（n = 7个人）。

（E）PB特异性UMAP突出了嗜中性粒细胞样细胞（NL）。较小的UMAP与PB标记（CD27，CD38和TNFRSF17）和中性粒细胞样标记（ELANE，MPO和CAMP）的表达相对应。

（F）B细胞群的细胞轨迹分析。通过使用Monocle3计算细胞轨迹。该分析源于过渡性B细胞（紫色），并分为2个分支：B细胞幼稚和记忆分支（灰色线，以黄色结束）和过度使用的PB分支（黑色线，以橙色结束）。

（G）PB中拟时序基因基因的点图。根据十个最具特征的基因表达增加来选择基因。颜色区分具有增加的（红色）表达或减少的（蓝色）表达的基因，点大小代表每组表达相应基因的细胞数。

（H）GO富集分析疾病轨迹中表达增加的基因。点的大小与基因比例成正比，而颜色则对应于富集的p值。所选的热门术语将可视化。

（I）B细胞亚型中目的基因的基因表达。根据感兴趣的基因在PB或NL中的高表达来选择它们。对于每个基因，描绘B细胞亚型表达的顶部小提琴图，基于拟时序的中央小提琴图和基于同类群组2（健康对照[白色]，轻度疾病[浅灰色]和重症疾病[深色]）表达的底部小提琴图。灰色的]）。

（J）富含B细胞群亚型的代谢途径。显示了在PB中重建的针对特定情境的代谢网络的前20条活跃代谢途径。对于每种B细胞亚型，通过使用Kruskal-Wallis检验确定了代谢活性的显著差异。每个通道发现的反应计数数量显示为颜色强度。

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图S6

8. 接下来，作者使用重链散装和scBCR-seq分析了不同B细胞群中的BCR组成（图S6 D，S6E和S6G-S6P）。在整体数据集中，作者共确定了596,882个唯一的BCR CDR3重链序列，而对于scBCR-seq，作者拥有涉及14,785个细胞的信息。
9. 多样性分析显示克隆性增强，在早期时间点急剧增加，然后在恢复期的拟时序逐渐降低，直到随访正常化（图S6 D和S6E）。大量的BCR在记忆B细胞和PB（图S5 H和S5J）中都鉴定出IgA ⁺和IgG ⁺细胞的扩增（图S5 G和S5I ）。
10. IGHA1增加和IGHG1更早在PBS中比在记忆B细胞达到表达。在scBCR-seq数据中确认了扩展的IgA ⁺和IgG ⁺ PB（图S5 K和S5N）。对免疫球蛋白重链可变区（IGHV）家族亚基的分析（图S5 L，S5M，S5O和S5P）显示，与对照组（例如IGHV3-30和IGHV3-）相比，COVID-19患者的特定V区占优势疾病期间PB和中性粒细胞样细胞中有23个过高表达

COVID-19中B细胞克隆性的增加，并且记忆B细胞和PB的增加，主要由IgA和IgG同种型以及IGHV的偏斜使用引起基因在疾病过程的早期。

11. 接下来，作者分析了6,295 PB的纵向基因表达模式（图5 G）。COVID-19患者的炎症性增高期的特征在于与内质网（ER）应激和蛋白质折叠（例如XBP1）和细胞增殖（例如PIM2和S100A4）有关的转录本。PB中存在I型IFN反应基因（IFI27，IFI6和IFITM1），直到疾病晚期（至拟时序5为止），但危重患者的PB中则不存在此类基因（拟时序2）。
12. 在整个疾病中，作者还发现SLC1A4表达增加，这是代谢变化的潜在上游调节剂（图5 I）。IL-16的高表达可在体液免疫应答启动期间支持CD4 ⁺ T细胞和循环血树突状细胞（DC）向淋巴器官的迁移（Kaser等，2000），这是 PB长期恢复的一个特征。（图5 G）。
13. GO富集分析确定了活动性疾病期间未折叠的蛋白质反应和线粒体ATP合成增加（图5 H）。通过使用另一种scRNA-seq技术，在轻度和重度COVID-19患者的独立队列（队列2）中也证实了这些发现（Schulte-Schrepping等人，2020年）。
14. 从该数据集中提取的2,263个PBs证实了重度与轻度COVID-19 PBs的强烈增加（分别占整个B细胞谱系的30％和8％），以及CD38，PIM2，IFI6，XBP1和SLC1A4等的表达增加富集的GO项（Fisher检验，未折叠的蛋白反应p = 1.80×10 ^-5，线粒体ATP合成p = 2.50×10 ^-8）。
15. PB可以通过充当营养库来调节免疫反应（Vijay等，2020）。因此，作者使用了基于约束的模型来从scRNA-seq数据重建单个细胞的代谢状态（Joshi等人，2020年; Pacheco和Sauter，2018年）。来自炎症状态的PB表现出较高的代谢活性，仅在恢复时才降低，而记忆和幼稚B细胞在疾病状态之间的总体代谢活性上没有显示出显著差异（图S7L）。PB中增加的代谢过程是氧化磷酸化，乙醛酸和二羧酸酯代谢，NAD合成以及各种氨基酸代谢途径（包括甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸）的增加。预计糖酵解在炎症疾病阶段具有低活性状态，而在临床恢复中则具有很高的活性（拟时序6）（图5 J）。总而言之，该分析确定了PBs的广泛活化，并暗示了细胞向氨基酸代谢的强烈的免疫代谢转变，这可能有助于重症COVID-19中所见的免疫病理学。

7. 巨核细胞数量升高是对COVID-19的全身炎症反应的特征

1. 众所周知，全身性炎症反应会消耗血小板，血小板除了具有公认的止血作用外，还具有广泛的免疫和炎症功能（Semple等，2011；Yeaman，2014）。肺栓塞和脑栓塞是导致COVID-19发病率和死亡率的重要因素（Liao等，2020）。鉴于作者已经观察到循环MK的瞬时增加，这是血小板的细胞来源（图2B），在单细胞数据和与血小板计数和D-二聚体水平相关的已确定的共表达模块（M3和M4）中，作者假设改变MK的存在和功能可能是COVID-19的独特特征。
2. 因此，作者通过使用进行鉴定为MKS和它们各自的造血干细胞前体细胞（造血干细胞）和MK-红细胞前体（MEPS）6512个细胞亚聚类ķ -nearest邻法（图6 A和S7 A）。
3. 这些细胞分为2个不同的亚组：5,870个被鉴定为真正的MK，另一个较小的包含所有HSC和MEP的簇（图6 B，S7B和S7C）。相对较少的细胞前体细胞使单个拟时序之间的比较变得复杂（图S7 D–S7G）。
4. 与健康对照组相比，恢复期的HSC和MEP显著增加（图S7 J）。
5. 通过仅关注MK，作者发现属于健康对照的样本与具有活性COVID-19的患者之间存在明显的分离（图6 C），
6. 特别是来自复杂疾病阶段的细胞与健康和长期恢复的细胞形成了不同的亚群。疾病阶段（图6 D和6E）。
7. 在危重患者中观察到伪编码丙酮酸激酶的PKM转录量（PKM2）大量增加，并与HIF1A相互作用并促进其活性（拟时序2）。在这一组中，还存在高表达的FCER1G，它编码负责整合素（ITGA2-GP6）介导的血小板粘附的常见FcRγ链衔接子（图6E）。
8. GO富集分析确定了与免疫应答，I型IFN应答和血小板聚集相关的广泛术语，这些术语将沿疾病轨迹改变（图6 G）。
9. 暂时减少的转录本由ODC1（鸟氨酸脱羧酶），多胺合成的限速酶（Kanerva等，2008）和TGFB1组成（图6 F）。IFITM3，IFI27和IFITM2在炎性拟时序1、2、3和4中表达增加，表明在整个MKs疾病轨迹中，IFN持续存在。
10. 此外，作者在轻度和重度COVID-19的独立队列中验证了作者的发现（Schulte-Schrepping等人，2020年），这不仅证实了重症患者中MK的数量更高（图6 H），而且证实了表达增加的IFITM3，PKM，ITGA2B（也称为CD41）和IFITM2以及重症患者中ODC1和TGFB1的表达降低（图6 F，底部）。
11. 与健康对照组相比，代谢建模确定了MKs沿疾病轨迹增加的代谢活性，尽管其水平低于PBs（图6 I）。显著的预测过程与能量代谢（丙酮酸代谢，糖酵解和活性氧[ROS]解毒）有关（图6 J和6I）。
12. 代谢模型推断糖酵解通向乳酸的通量显著增加，甲基乙二醛途径的诱导（Kalapos，2008）和已知抑制血小板聚集的亚精胺-多胺产物的减少（de laPeñaet al。，2000）。

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图6巨核细胞水平升高是COVID-19的特征

（A）原理图工作流程。

（B）MK及其前身为UMAP。总共描绘了6,512个细胞。显示了MK（绿色），HSC（粉红色）和MEP（黄色）。

（C）表示为UMAP的MK拟时序。总共描绘了5,870个细胞。

（D）跨COVID-19疾病轨迹的MK。对于每个UMAP，用颜色突出显示了拟时序特定的细胞。

（E）MK中疾病轨迹特征基因的点图。根据十个最具特征的基因的表达量选择基因。颜色区分具有增加的（红色）表达或减少的（蓝色）表达的基因，点大小代表每组表达相应基因的细胞数。

（F）在MK中表达目的基因。根据疾病分类，基于拟时序的顶部小提琴图和基于队列2的底部小提琴图；健康对照（白色），轻度疾病（浅灰色）和重度疾病（深灰色）。

（G）GO富集分析在疾病轨迹中表达增加的基因。点大小与基因比例成正比，颜色对应于富集的p值。所选的热门术语将可视化。

（H）队列2 MK比例按疾病重症程度分组。描绘了健康对照（白色），轻度疾病（浅灰色）和重度疾病（深灰色）。

（I）富含MK的代谢途径。显示了针对特定背景的代谢网络重建的顶级差异活性代谢途径。通过使用Kruskal-Wallis检验确定了代谢活性的显著差异。每个途径的反应计数数量显示为颜色强度。

（J）MKs中的丙酮酸代谢。描绘了拟时序的丙酮酸代谢途径活性反应的数量。基于Kruskal-Wallis检验的p值。每个拟时序的模型数在每列上方表示为n。

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图S7

8. 一组重症COVID-19患者的共表达模块与临床结果的关联

1. 最后，作者集中研究了来自奈梅亨的拉德布德大学医学中心（UMC）的40名机械通气，重症COVID-19患者的纵向队列在临床背景下获得的基因的潜在重要性（队列3）（表S4）。
2. 该队列中的大量RNA测序数据是在入ICU的两个时间点获得的。作者使用匹配的样本对，其幸存者（n = 33）和非幸存者（n = 7）具有类似的增加的炎症活性变化，并询问模块基因表达量的变化（M1-M10，如德国纵向队列[队列1]最初在两个时间点之间（图7）显示在图4 A中一种）。
3. 第一个样本是在ICU入院后3天中位数获得的，时间点之间的中位数时间为2天，幸存和未幸存的患者之间没有系统性差异。非幸存者的第二个时间点在死亡前4–35天之间变化。在此纵向比较中，三个模块得到了显著调节。
4. 与I型IFN反应失败相关的M2转录本在幸存者和非幸存者中均显著降低，从而证实了IFN失调与重症疾病之间的关联（Blanco-Melo等人，2020 ; Hadjadj等人，2020）。
5. M4表示外周血中的MK以及升高的D-二聚体水平和M7转录物，与红系分化和MK相关，仅在COVID-19非幸存者中比 2天后的随访时间点较ICU入院时的样本和MCU的变化显著增加。（图7B）。
6. 在一种相反的方法中，作者询问幸存者和非幸存者在两个时间点之间哪些转录本在纵向上显示出不同的表达方式。作者发现，在幸存者中只有3个转录物受到调控，而在非幸存者中有182个转录物显著不同（图7 C）。
7. 在这些转录本中，有130个包含在队列1的先前定义的时间共表达模块中，其中大量涉及M2，M4和M7的转录本。这些与死亡相关的转录本的细胞类型特异性表达模式（每种细胞类型的平均表达值，来源于scRNaseq队列1）显示，M2基因的标记标记了各种各样的细胞类型，例如单核细胞，粒细胞，NK细胞，增殖淋巴细胞和CD8 +T细胞，M3和M4基因主要对单核细胞具有特异性，很少有归因于MK的高表达转录本。M7基因的很大一部分都涂上了类红细胞谱系，在MK中特异性表达了一个单独的簇，例如PBX1，TRIM58和PDZK1IP1（图7 D）。
8. 最后，作者通过使用limma的中度t检验量化了幸存者和非幸存者中TFs随时间的差异调节（Ritchie等人，2015年）。分析确定了仅在非幸存者中被差异调节的16个TF，在幸存者中有7个TF（图7 E）。REACTOME通路富集显示，在非幸存者TF中，术语“MK发育和血小板生成”（p = 0.0001）和“ TRAF6介导的促炎性细胞因子的诱导”（P= 0.001）显著丰富。

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图7重症COVID-19患者纵向队列中共表达模块的临床意义

（A）原理图工作流程。

（B）M2，M4和M7在幸存者和非幸存者中两个采样时间点之间的模块本征基因比较。误差棒表示四分位距离为1.5，* p <0.05（Mann Whitney测试）。

（C）火山图，描绘了非幸存者在两个采样时间点之间的log ₂倍变化和FDR调整后的p值。基因由相应的共表达模块进行颜色编码。深色代表明显的DEG。

（D）热图显示了在队列1的不同细胞类型中在非幸存者中鉴定的DEG的平均表达（来自scRNA-seq数据）。显示了该疾病重症阶段（拟时序1、2和3）的平均表达。逐行Ž平均基因计数的-scores绘制在热图和分层群集为每个模块单独地。

（E）火山图，描绘了非幸存者（右）对幸存者（左）随时间变化的TF活性与-log10转换后的p值。显著TF（p <0.1）用红色标记。