序 言
ChIPseeker用来注释peak确实很方便，也内置了不少的可视化函数可以用来展示结果。ChIPseeker基于annotatePeak函数做注释虽然使用起来很简单，但在其内部却存在着三种独立的注释方式，分别为nearest gene annotation、genomic annotation、flankDistance。下面咱们就来具体看看这三种注释方式分别是什么，以及哪些参数可以控制其行为。
nearest gene annotation
该注释与其他软件理念一致，就是根据距离寻找与peak的最近基因，距离的计算依据是TSS，即注释结果中的distanceToTSS列。该注释方式其实是由内部的getNearestFeatureIndicesAndDistances函数完成，涉及到的参数如下：
Description:
get index of features that closest to peak and calculate distance
Usage:
getNearestFeatureIndicesAndDistances(
peaks,
features,
sameStrand = FALSE,
ignoreOverlap = FALSE,
ignoreUpstream = FALSE,
ignoreDownstream = FALSE,
overlap = "TSS"
)
annotatePeak函数注释时会调用getNearestFeatureIndicesAndDistances函数，所以annotatePeak里面那些同名的参数会被getNearestFeatureIndicesAndDistances使用。也就是说，这些参数会影响nearest gene annotation的注释结果。这些参数在软件里面都有相应的解释，这里就不再赘述了。不过，ignoreOverlap、overlap这两个参数有点不好理解，为了搞清楚其对结果会有什么影响，就去扒拉了一下源码，其中涉及到这两参数的代码如下：
if (!ignoreOverlap && overlap == "all") {
overlap_hit <- findOverlaps(peaks, unstrand(features))
}
features <- resize(features, width = 1)
... ...
... ...
if (!ignoreOverlap) {
if (overlap == "all") {
hit <- overlap_hit
if (length(hit) != 0) {
qh <- queryHits(hit)
hit.idx <- getFirstHitIndex(qh)
hit <- hit[hit.idx]
peakIdx <- queryHits(hit)
featureIdx <- subjectHits(hit)
index[peakIdx] <- featureIdx
distance_both_end <- data.frame(start = start(peaks[peakIdx]) -
start(features[featureIdx]), end = end(peaks[peakIdx]) -
start(features[featureIdx]))
distance_idx <- apply(distance_both_end, 1, function(i) which.min(abs(i)))
distance_minimal <- distance_both_end[, 1]
distance_minimal[distance_idx == 2] <- distance_both_end[distance_idx ==
2, 2]
distanceToTSS[peakIdx] <- distance_minimal *
ifelse(strand(features[featureIdx]) == "+",
1, -1)
}
}
hit <- findOverlaps(peaks, unstrand(features))
if (length(hit) != 0) {
qh <- queryHits(hit)
hit.idx <- getFirstHitIndex(qh)
hit <- hit[hit.idx]
peakIdx <- queryHits(hit)
featureIdx <- subjectHits(hit)
index[peakIdx] <- featureIdx
distanceToTSS[peakIdx] <- 0
}
}
从上面的代码可以看出，overlap参数受ignoreOverlap影响，如果ignoreOverlap设定为true，无论overlap设定为TSS或是all结果都一样。ignoreOverlap默认值为false，从上面的代码可以看出overlap设定为TSS或者all改变了peak寻找overlap区域的规则，设为TSS时是以转录起始位点为依据，而设为all是以整个基因区域为依据，故此时改变overlap的参数会影响注释的结果。注释结果中geneChr、geneStart、geneEnd、geneLength、geneStrand、 geneId、transcriptId、distanceToTSS、ENSEMBL、SYMBOL、GENENAME这些列都属于该注释方式，其中最后三列取决于有没有提供annoDb参数。
genomic annotation
该注释方式为直接寻找与peak有overlap的基因组区域，即基因组内定义的不同功能区域，分别为Promoter、5UTR、3UTR、Exon、Intron、Downstream、Intergenic。这个注释方式是由内部的getGenomicAnnotation函数完成，涉及到的参数如下：
Description:
get Genomic Annotation of peaks
Usage:
getGenomicAnnotation(
peaks,
distance,
tssRegion = c(-3000, 3000),
TxDb,
level,
genomicAnnotationPriority,
sameStrand = FALSE
)
distance参数是由nearest gene annotation计算出的peak到TSS距离，这个参数可以忽略。这里的参数都很容易理解，就不再解释了。annotatePeak函数里面的assignGenomicAnnotation参数直接控制了是否做这个注释，默认包含这个结果，设置为false结果中就没有annotation这一列了。如下所示：
peakanno <- annotatePeak(peak, TxDb=txdb, assignGenomicAnnotation=F, verbose=F)
head(as.data.frame(peakanno))
seqnames start end width strand V4 V5 V6 V7
1 chr1 177887 178346 460 * macs2/spi1_peak_1 63 . 5.02370
2 chr1 502490 502734 245 * macs2/spi1_peak_2 114 . 8.47362
3 chr1 816135 816585 451 * macs2/spi1_peak_3 687 . 27.23509
4 chr1 817259 817655 397 * macs2/spi1_peak_4 30 . 4.25229
5 chr1 825329 825528 200 * macs2/spi1_peak_5 42 . 4.87237
6 chr1 906748 907307 560 * macs2/spi1_peak_6 113 . 6.11296
V8 V9 V10 geneChr geneStart geneEnd geneLength geneStrand
1 8.41215 6.35401 169 1 182696 184174 1479 1
2 13.72868 11.49205 159 1 494464 502508 8045 2
3 71.78964 68.76992 193 1 817371 819837 2467 1
4 4.98931 3.09637 270 1 817371 819837 2467 1
5 6.17494 4.21122 51 1 825138 849592 24455 1
6 13.58947 11.36661 157 1 917370 918534 1165 2
geneId transcriptId distanceToTSS
1 102725121 ENST00000624431.2 -4350
2 100132287 ENST00000440038.7 0
3 400728 ENST00000326734.2 -786
4 400728 ENST00000326734.2 0
5 643837 ENST00000624927.3 191
6 100130417 ENST00000432961.1 11227
flankDistance
该注释从peak的角度出发寻找上下游某个范围内的所有基因，由内部的getAllFlankingGene函数完成，下面是该函数的参数定义：
function (peak.gr, features, level = "transcript", distance = 5000)
从上面的定义可知，用户可以用来控制结果的参数为level、distance，参数的意义也很好理解。如果需要这个注释，将annotatePeak的参数addFlankGeneInfo设为true即可，结果就会多出flank_txIds、flank_geneIds、flank_gene_distances三列信息。
peakanno <- annotatePeak(peak, TxDb=txdb, addFlankGeneInfo=T, verbose=F)
head(as.data.frame(peakanno),3)
seqnames start end width strand V4 V5 V6 V7
1 chr1 177887 178346 460 * macs2/spi1_peak_1 63 . 5.02370
2 chr1 502490 502734 245 * macs2/spi1_peak_2 114 . 8.47362
3 chr1 816135 816585 451 * macs2/spi1_peak_3 687 . 27.23509
V8 V9 V10 annotation geneChr geneStart geneEnd geneLength
1 8.41215 6.35401 169 Distal Intergenic 1 182696 184174 1479
2 13.72868 11.49205 159 Promoter (<=1kb) 1 494464 502508 8045
3 71.78964 68.76992 193 Promoter (<=1kb) 1 817371 819837 2467
geneStrand geneId transcriptId distanceToTSS
1 1 102725121 ENST00000624431.2 -4350
2 2 100132287 ENST00000440038.7 0
3 1 400728 ENST00000326734.2 -786
flank_txIds
1 ENST00000624431.2
2 ENST00000440038.7;ENST00000423728.6;ENST00000616311.5
3 ENST00000326734.2
flank_geneIds flank_gene_distances
1 102725121 -4350
2 100132287;100132287;100132287 0;-3315;-3514
3 400728 0
结 语
ChIPseeker的三种注释之间相互独立，所以结果就会出现信息不对称的现象，比如annotation注释到的转录本或基因可能与geneId、transcriptId列不同。ChIPseeker做注释虽然很简单，但其中还是有不少的细节需要注意以便更准确地理解结果。关于ChIPseeker的应用这里并没有详细的介绍，网络上也有不少这方面的帖子可供参考，不过之前也写过一篇个性化注释的帖子，感兴趣的可以戳这里：[个性化ChIPseeker注释peak结果]。以上内容为个人理解，仅供参考。
