前言
今天给大家分享的文献是2024年3月16日发表在“Journal of Translational Medicine”的一篇将干湿结合经典的文章，题目是《Single-cell transcriptomic sequencing data reveal aberrant DNA methylation in SMAD3 promoter region in tumor-associated fibroblasts affecting molecular mechanism of radiosensitivity in non-small cell lung cancer》，很适合新手小白训练科研思维！
研究背景：肺癌是全球最流行的癌症类型，与其他癌症类型相比，导致的死亡人数最多。在小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两种类型的肺癌中，非小细胞肺癌的发病率最高，且这类肺癌患者预后差，5年生存率低。目前肺癌的治疗策略包括手术、放射治疗和化疗。然而，由于在早期诊断和恶性转移方面的挑战，肺癌患者的死亡风险仍然非常高。辐射抵抗是非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中的一个重要问题，也是癌症相关死亡的主要原因。
这项研究利用GEO数据库(6个数据集)中的基因表达数据来鉴定与非小细胞肺癌放射治疗耐药相关的差异表达基因。作者首先使用GSE37745数据集，通过COX回归和生存分析识别预后基因；随后利用基因集浓缩分析(GSEA)和共表达分析探讨目的基因的功能作用，最后使用UALCAN、DNMIVD和UCSC Xena等数据库评估了基因启动子甲基化水平，而Tisch数据库提供了对目标基因和CAF之间的相关性的见解。此外，实验包括非小细胞肺癌患者样本的RT-qPCR、Western印迹和免疫组织化学，分离的CAF细胞的体外研究，以及体内裸鼠肿瘤模型的研究。最后得出研究结论：SMAD3在非小细胞肺癌组织、细胞和CAF中的高表达与预后不良和放疗耐药增加密切相关。SMAD3可能通过激活ITGA6/PI3K/Akt信号通路增强NSCLC细胞的放射抗性。
主要内容
一、基于GEO数据集，识别了15个与非小细胞肺癌辐射抗性相关的基因
作者首先从GEO数据库(GSE2514、GSE18842、GSE21933、GSE31552和GSE44077)中筛选出相比正常对照组，在非小细胞肺癌的上调或下调的DEG,5个数据集取交集分析后，637个上调的DEG和610个下调的DEG。鉴于放射抵抗对非小细胞肺癌(NSCLC)患者生存的显著影响，作者对GSE20549数据库中的NSCLC细胞系进行了差异分析。作者用|logFC|>1、FDR<0.05和P值<0.05的阈值来确定放射抵抗和放射敏感性。结果，作者鉴定了2795个差异表达基因(DEG)，包括1574个上调的DEG和1221个下调的DEG。通过对NSCLC组织和辐射抗性NSCLC细胞系中上调的DEGs进行Venn图分析，获得了60个与辐射抗性相关的基因(图1A)。之后使用string数据库构建了PPI网络，并用Cytoscape软件进行了可视化。(图1B)。节点DEGree较多的前15个基因分别为：MCM4、FOXM1、NCAPD2、CDT1、NDC80、HDAC1、KIF2C、MELK、TPX2、HDAC2、SMAD3、HIST1H2BJ、LEF1、FBL和MMP13(图1C)。
二、SMAD3在CAF中的高表达与NSCLC患者预后不良密切相关
为了确定所获得的15个放射抵抗基因与非小细胞肺癌患者预后的相关性，作者对GSE37745数据集进行了单因素Cox回归分析，发现SMAD3在非小细胞肺癌中的预后价值最大，是一个高危基因(图2A)。RT-qPCR结果显示，上述15个基因的表达均有不同程度的上调，其中SMAD3在临床组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。(图2B)。Kaplan-Meier绘图仪数据库的分析结果显示，SMAD3的高表达与NSCLC患者的总体生存呈负相关(图2C)。此外，免疫组织化学结果表明，SMAD3在非小细胞肺癌组织中的蛋白表达上调(图2D)。单因素COX回归分析显示，SMAD3表达、肿瘤分期和年龄对非小细胞肺癌患者的总体生存有显著影响(图2E)。多因素COX回归分析显示，SMAD3表达、肿瘤分期和年龄是影响非小细胞肺癌预后的独立因素(图2F)。根据这三个独立的预后因素构建了预测NSCLC患者生存率的诺模图(图2G)，解释了预测的1、2和3年生存率与实际生存率高度一致(图2H)。提示SMAD3的高表达与非小细胞肺癌患者的预后不良有关。
CAF已被公认为是肿瘤微环境的主要组成部分，可诱导肿瘤放射抵抗,作者试图进一步验证SMAD3表达与CAF之间的相关性。对来自Tisch数据库的NSCLC相关scRNA-seq数据集的分析表明，SMAD3高度富含CAF(图2I)。因此，SMAD3可作为一个独立的预后因素，其高表达与NSCLC患者的预后不良相关。此外，在肿瘤微环境中，SMAD3在CAF中也有高表达。
三、SMAD3高表达与其启动子DNA低甲基化相关
接下来，作者着手确定SMAD3表达的失调是否与其甲基化状态的改变有关。使用UALCAN(图3A，B)和DNMIVD数据库(图3A，B)进行分析。肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)组织中SMAD3基因启动子区DNA甲基化水平显著低于正常肺组织。此外，在LUAD和LUSC组织中，SMAD3表达的增加与SMAD3启动子的低甲基化有关(图3E，F)。此外，SMAD3启动子区域的DNA甲基化水平SMAD3高表达组低于SMAD3低表达组(图3G，H)。同时，MSP结果显示，与癌旁正常组织相比，肿瘤组织中SMAD3启动子区域的DNA甲基化水平降低(图3I)。因此，SMAD3在非小细胞肺癌中的高表达与其启动子低甲基化有关。
四、SMAD3通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路促进非小细胞肺癌细胞辐射抗性
随后，本研究旨在阐明SMAD3在非小细胞肺癌中的潜在调控机制。用GSEA分析SMAD3的功能表明，SMAD3的高表达与包括NSCLC在内的多种癌症以及与癌症相关的通路，如PI3K/Akt/mTOR和KRAS(图4A，B)有关。此外，通过差异分析(图4C，D)，在SMAD3高表达组和低SMAD3表达组之间筛选出95个DEG，其中32个DEG与SMAD3表达相关，Spearman相关分析(图4E)显示。此外，在放射治疗相关数据库GSE20549中发现了6个基因。(图4F)。其中，ITGA6在辐射抗性组织中高表达，并与SMAD3的表达呈正相关(图4G)。此外，ITGA6已被证明通过PI3K/Akt信号通路增强辐射抗性。因此，作者推测SMAD3可能通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路来增强NSCLC细胞的辐射抗性。免疫组织化学结果显示，ITGA6I在肿瘤组织中的表达增加(图4H)。Western印迹结果显示，与癌旁正常组织相比，肿瘤组织中PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平增加，而总Akt蛋白表达不变(图4I)。这些结果提示SMAD3可能通过激活ITGA6/PI3K/Akt来增强非小细胞肺癌细胞的辐射抗性。
五、CAF中SMAD3启动子区域DNA低甲基化增加NSCLC细胞的辐射抗性
上述生物信息学结果随后在体外实验中得到验证。RT-qPCR结果显示，SMAD3在非小细胞肺癌细胞中的表达高于人支气管上皮细胞16HBE，其中在H1299细胞中的表达最高，在H460细胞中的表达最低(图5A)，因此 H1299和H460细胞用于后续实验。CCK-8结果显示，与16HBE细胞相比，暴露于不同剂量的X射线辐射后，NSCLC细胞的存活率下降(补充FLE3：图S3A)，这与SMAD3在细胞中的表达一致。结果表明，SMAD3在非小细胞肺癌细胞中高表达，并与辐射抗性有关。人肺NAF和CAF成功地从新鲜的非小细胞肺癌和邻近的正常组织中分离出来(补充FLE3：图S3B、C)。RT-qPCR和Western印迹结果显示，SMAD3在CAF和CAF-CM中的表达高于NAF和NAF-CM(图5B，C)。此外，MSP-PCR结果显示，与NAF相比，CAF中SMAD3启动子区域的DNA甲基化水平降低(图5D)。这提示CAF中SMAD3启动子区域低甲基化，而SMAD3表达上调。
接下来，作者将SMAD3基因导入NSCLC细胞或在NSCLC细胞中加入CAF条件培养液(CM)。RT-qPCR扩增结果(图5E)显示，OE-SMAD3和CAFS-CM处理的NSCLC细胞中SMAD3的表达上调，而sh-SMAD3(随后用sh-SMAD3-1进行实验)则下调。需要注意的是，胞外SMAD3分子并不直接进入NSCLC细胞发挥其功能。作者推测SMAD3与NSCLC细胞膜上的ITGA6结合。随后，作者收集细胞进行Western blotting实验，在CAF-CM组，作者观察到细胞裂解物中SMAD3蛋白水平的增加(图5E)。结合作者先前发现的CAFS-CM(图5C)中SMAD3蛋白含量显著增加的观察，以及ITGA6作为一种跨膜黏附受体蛋白，支持作者的假说。此外，除了作为阳性对照，SMAD3在NSCLC细胞中的过表达进一步证实了CAFS-CM诱导的表型结果的特异性，并排除了CAFS-CM中存在的其他细胞因子的影响。
用不同强度的辐射作用于NSCLC细胞，CCK8结果显示(图5F)在NSCLC细胞中高表达SMAD3可提高细胞活力，而沉默SMAD3则导致细胞活力下降。进一步用6Gy射线处理细胞，集落形成和Transwell实验表明(图5G-H)高表达SMAD3增强了集落形成和侵袭能力，而沉默SMAD3则相反。用γ-H_2AX免疫荧光染色检测细胞的DNA双链断裂。γH_2AX免疫荧光染色和流式细胞仪检测结果显示，在SMAD3高表达组，γH_2AX荧光强度降低，表明DNA损伤减轻，细胞凋亡减少。此外，处于G0/G1期的细胞比例下降，而处于S期和细胞分裂的细胞比例增加。当SMAD3被沉默时，TE结果正好相反。总之，CAF中SMAD3启动子区域的DNA低甲基化可以诱导NSCLC细胞的辐射抗性。
六、CAF中的SMAD3激活了NSCLC细胞中的ITGA6/PI3K/Akt通路
CAF中SMAD3激活NSCLC细胞中ITGA6/PI3K/Akt通路的验证是下一个研究重点。RT-qPCR和Western印迹结果显示，与16HBE细胞相比，NSCLC细胞ITGA6的mRNA和蛋白的表达增加，其中H1299细胞的表达最高，H460细胞的表达最低。此外，PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平升高，而总Akt蛋白表达保持不变(图6A，B)。如图所示6C、D处理后，OE-SMAD3或CAF-CM可促进ITGA6、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平，但对总Akt蛋白表达无明显影响。相反，SMAD3沉默导致了相反的结果，除了总Akt蛋白的表达没有变化。总之，CAF来源的SMAD3可以激活NSCLC细胞中的ITGA6/PI3K/Akt通路。
七、ITGA6/PI3K/Akt通路激活促进非小细胞肺癌细胞辐射抗性
接下来作者进一步在验证ITGA6/PI3K/Akt信号通路在非小细胞肺癌细胞辐射抗性中的作用。RT-qPCR结果表明，oe-ITGA6处理的H460细胞中ITGA6的表达增强，而H1229细胞中的sh-ITGA6下调ITGA6的表达，其中sh-ITGA6-1的下调最为明显(图7A)，从而用于后续的检测。在图7B中，除了未受影响的总Akt蛋白表达外，过表达ITGA6还增强了PI3K蛋白的表达和Akt的磷酸化水平，而不改变总Akt蛋白的表达，但沉默ITGA6还下调了PI3K蛋白的表达和Akt的磷酸化水平。这些结果支持ITGA6正向调节PI3K/Akt通路。此外，在不同剂量的X射线照射下，存在ITGA6过表达可促进细胞活力，而沉默ITGA6则导致相反的结果(图7C)。在6GyX射线照射下，ITGA6的过度表达促进了细胞克隆的形成和侵袭，这一作用被ITGA6的沉默所抵消(图7D，E)。此外，ITGA6过表达减弱了γH_2AX荧光强度，减少了DNA损伤、细胞凋亡和G0/G1期阻滞细胞，而增加了6GyX射线照射后的S期阻滞细胞和细胞分裂；而ITGA6沉默后的结果则相反(图7F-H)。
八、CAF来源的SMAD3通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路增加NSCLC细胞的辐射抗性
RT-qPCR和Western印迹结果显示，与SMAD3过表达或CAF-CM单独作用相比，经sh-ITGA6和oe-SMAD3或sh-ITGA6和CAF-CM共同作用的H460细胞中，SMAD3表达和总Akt蛋白表达无明显变化，但其ITGA6表达、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平均降低。在sh-SMAD3+oe-ITGA6处理的H1229细胞中，SMAD3的表达和总Akt蛋白的表达没有变化，而ITGA6的表达、PI3K蛋白的表达和Akt的磷酸化水平都有所提高(图8A，B)。在暴露于不同剂量的X射线照射后，用sh-ITGA6+ oe-SMAD3处理的细胞活力受到损害，而用sh-SMAD3+ oe-ITGA6处理的细胞活力则保持不变(图8C)。此外，经6GyX射线照射后，经sh-ITGA6+ oe-SMAD3处理后，γH_2AX荧光强度、DNA损伤、细胞凋亡率和G0/G1期阻滞细胞数增加，细胞集落形成和侵袭减少，细胞分裂明显受阻(图8D-H)。综上所述，CAF来源的SMAD3可通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路增强NSCLC细胞的辐射抗性。
九、CAFS来源的SMAD3在体内通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路促进NSCLC细胞的生长和辐射抵抗
最后，作者进一步研究了CAFS来源的SMAD3是否促进了NSCLC细胞的辐射抵抗细胞内通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路。如图所示H460/oe-SMAD3+或H460/CAFS+Gy9A-C组小鼠肿瘤体积和重量增加，H460/ oe -SMAD3+sh-ITGA6+Gy组和H460/CAFS+sh-ITGA6+Gy组小鼠肿瘤体积和重量减小。RT-qPCR和Western印迹结果显示，H460/oe-SMAD3+Gyr和H460/CAFS+Gy2组小鼠肿瘤组织中SMAD3、ITGA6、PI3K蛋白的表达和Akt的磷酸化水平均增强，而总Akt蛋白的表达无明显变化。相反，H460/ oe-SMAD3+sh-ITGA6+GY或H460/CAFS+sh-ITGA6+GY的结果与未改变Akt蛋白表达的结果相反(图9D，E)。此外，图9F，G中所示的数据解释了H460/ oe-SMAD3+GY或H460/CAFS+GY反应中Ki67阳性肿瘤细胞的高百分比和低细胞凋亡率。而H460/ oe-SMAD3+sh-ITGA6+GY或H460/CAFS+sh-ITGA6+GY则逆转上述效应。
综上所述，上述结果表明，CAF来源的SMAD3可能通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路，促进NSCLC肿瘤的体内生长，增强肿瘤的放射抗性。
文章机制图：
SMAD3在CAF中显著高表达，其很可能可能通过激活ITGA6/PI3K/Akt通路，从而促进NSCLC细胞的辐射抗性
Majic有话说
这篇文章虽然题目里面涉及单细胞，但是文章内容单细胞分析并不多，大部分是转录组bulk RNA-seq分析，如果进一步进行单细胞高级分析:细胞通讯分析，拟时序分析等，可能文章会更出彩。但是文章基础实验很扎实，做了很多工作，特别是根据某一个特点的科学问题系统筛选出关键基因，最后再通过实验进行验证的思路值得我们学习。但是Majic读下来感觉在SMAD3在肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞之间的关系讲的也不是很透彻，当然作者可能做了没有拿到好的结果，抑或是作者没有条件做更深入的功能性实验。
不过，这篇干湿结合的方法值得我们学习借鉴！各位客官，今日分解到此结束，咱们下回见！关于文献中涉及的问题欢迎后台或者评论区留言！
原文链接：
https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12967-024-05057-2
