十四、急性出血性结膜炎(红眼病、丙类、EV70/CA24v亚洲多、VP1基因→用于诊断)
传染性极强、急性病毒性眼病、结膜发红。
肠道病毒70型or柯萨奇病毒A24型及变异株
潜伏期很短、眼刺激症状重、2周自愈。
(一)病原
微小核糖核酸病毒科（小RNA病毒？）新型肠道病毒70型<u>EV70</u>or柯萨奇A24型变种<u>CA24v</u>(亚洲多)。
单股正链RNA、耐酸、乙醚、抵抗一般消毒剂、脂溶剂。<u>紫外线、氧化剂、高温干燥</u>敏感。
两种病毒临床表现基本相同、不能区别。同时流行感染。
(二)病原分离方法
- 采取标本
发病1~3 d →结膜拭子→结膜囊、结膜表面涂擦→冷藏运送 - 分离病原
患病后第1天分离率最高
Hela、Hep-2细胞、人胚肾等 - 病原分离的诊断价值
病毒分离阳性→确诊
有助分型
(三)特征性基因检测
VP1基因→用于诊断、RT-PCR
十五、致腹泻病毒(病毒性肠胃炎、丙类、肠道腺病毒Ead)
病毒感染肠道、主要:呕吐&腹泻、可伴有发热、厌食、腹痛、全身不适等“中毒症状”、<u>自限性</u>急性感染性腹泻(病毒性肠胃炎)。丙类
首要病原体是轮状病毒、其次<u>肠道腺病毒Ead</u>、杯状病毒、星状病毒、肠道病毒(含埃可病毒、柯萨奇病毒)、冠状病毒。
侵犯<u>十二指肠</u>&<u>空肠黏膜细胞</u>。病毒蛋白发挥肠毒素作用、诱导细胞过度分泌→腹泻。通常<u>2周内</u>恢复。
病毒性腹泻-世界范围内流行，粪口途径。表现方式①5岁以内小儿腹泻②年龄无关的暴发流行。无特效药、<u>对症补液</u>。
(一)病原
-
轮状病毒RV（VP6抗原性不同分组）
呼肠孤病毒科、形如车轮。
核心蛋白VP6为组、亚组的特异性抗原，依据VP6抗原性的不同→分为A~G组。ABC三组致人腹泻。
- A组 6月龄~2岁婴幼儿
- B组 青壮年肠胃炎(☆首先由我国确定)
- C组 散发的儿童腹泻
<u>外壳蛋白VP4、VP7</u>具有中和抗原活性，刺激产生中和抗体。
- VP7→RV的G型
- VP4→RV的P型
主要流行型:<u>G1P、G2P、G3P、G4P</u>。
轮状病毒耐乙醚、弱酸、碱、反复冻融。pH适应广3.510，粪便中数天数周。55℃ 30 mins 灭活。
- 杯状病毒
杯状病毒科，电镜下32个<u>杯状表面凹陷</u>。
成人&大龄儿童、流行性<u>非细菌性胃肠炎爆发最重要病原体</u>。
单链正RNA、对热&酸稳定、抵抗乙醚。 - 肠道腺病毒Ead
腺病毒科，致腹泻的有:腺病毒<u>F亚属40、41血清型</u>。
主要<u>2岁以下儿童</u>，婴幼儿病毒性腹泻第2位病原体。
耐酸碱、56℃ 2~3 mins 灭活。 - 星状病毒
电镜下病毒颗粒呈<u>星形，表面5~6个星芒状突起结构</u>。
单股正链RNA，**7种血清型，最常见是Ⅰ型。
<u>婴幼儿、老人、免疫缺陷病人</u>腹泻重要病原。
(二)病原分离、特征性抗原和抗体的检测
轮状病毒
病原分离方法
急性期粪便→密度梯度离心→分离病毒
恒河猴胚肾细胞系MA-104→培养A组&C组RV→电镜or免疫电镜检查病毒-
抗原与核酸检测
- 测粪便中病毒抗原:ELISA、免疫酶联斑点试验、放免法、免疫荧光。
- 粪便中提取病毒RNA:聚丙烯酰氨凝胶电泳&银染色，检查<u>RNA电泳图谱</u>，A组RV-4232、B组-4223、C组-4322
- 粪便提取物→巢式RT-PCR检查RNA→<u>G型&P型</u>的基因分型。
抗体检测
感染5天后，ELISA检测IgM抗体，<u>5岁以下儿童几乎都感染过A组轮状病毒</u>。
RV感染后机体IgM、IgG对同型病毒有保护作用、肠道SIgA对异型有部分保护作用。杯状病毒
标本采取方法
潜伏期和排毒时间均很短、发病24h粪便排出病毒高峰、72h后难以检出。
密度梯度离心法→分离病毒→电镜or免疫电镜检查
无法培养、无动物模型特征性基因与抗原
ELISA、固相放免法测粪便中的病毒抗原
RT-PCR、Real Time RT-PCR 检测特异性基因片段抗体检测
酶免疫吸附法（EIAs）、放免法测血清特异性抗体，双份抗体效价↑有诊断意义。
我国IgG抗体阳性率89%、婴儿99%肠道腺病毒
病原分离方法
急性期粪便→密度梯度离心→分离病毒
人胚肾细胞株HEK-293、Hela、A549→电镜or免疫电镜检查病毒特征性基因与抗原
ELISA、免疫荧光法→对粪便抗原检测
从粪便抽提DNA→SmaI酶切和凝胶电泳分析酶切图谱检测、PCR、探针杂交、序列分析抗体检测
ELISA→双份血清IgM抗体检测→4倍↑诊断，50%4岁儿童抗体+星状病毒
病原分离方法
急性期粪便→密度梯度离心→分离病毒
人胚肾细胞、大肠癌细胞→直接或免疫电镜（IEM）、免疫荧光检查特征性基因与抗原
酶联免疫吸附（EIA）→检测粪便中病毒抗原
粪便中抽提RNA→RT-PCR、探针杂交、序列分析---核酸检测抗体检测
ELISA→双份血清IgM抗体检测→4倍效价↑诊断
3~4岁儿童抗体阳性率64%
十六、森林脑炎病毒
中枢神经系统症状为主要表现、高热伴瘫痪。
属于<u>生物安全4级</u>的高致病性病原微生物
自然疫源性疾病。需要森林环境、动物宿主、特定蜱种。主要通过带毒蜱叮咬感染、饮用未煮熟的被感染牛羊奶也可感染。
(一)病原
- 分类学地位
黄病毒科黄病毒属。
蚊传黄病毒：登革热、乙脑、黄热病毒 血清组
蜱传(黄)病毒：蜱传脑炎病毒复合群（蜱传脑炎病毒、科萨努尔森林脑炎病毒...）
- 主要生物学性状
球形颗粒、单股正链RNA
多种动物易感，小白鼠高度易感、鸡胚很好繁殖。
多种细胞敏感，Vero、BHK-21等常规细胞均可培养。 - 基因组结构
略 - 致病过程
皮下组织细胞繁殖→淋巴结→内脏淋巴结组织→内脏繁殖→血液、神经系统→中枢神经系统症状
(二)病原分离方法
- 采取标本
- 发病1周内、血液、分离率较低
- 死亡12小时内、脑干组织、分离率高
- 分离病原
- 出生3日内乳鼠、最敏感动物，脑内、腹腔联合接种
- 7日龄鸡胚、卵黄囊接种
- 鸡胚纤维母细胞、猪肾细胞，微量细胞培养，产生病变&空斑，比小白鼠更敏感。
- 病原分离的价值
对临床诊断意义不大，临床依靠血清学
(三)特征性基因与抗原检测
PCR→针对5`端非编码区的引物最常用
(四)抗体检测
- IgM捕获ELISA法--适用于早期诊断
IgM特异性抗体、病后1周内滴度较高、2周高峰、5个月消失 - 补体结合抗体测定
能维持半年、检出“补体结合抗体”→半年内感染过，双份血清4倍↑诊断价值 - 血凝和血凝抑制试验
感染病毒的鼠脑→蔗糖-丙酮法→提取血凝素→鸽血细胞凝集效果＞鹅血细胞
血凝抑制抗体→中和抗体 正相关
十七、水痘-带状疱疹病毒
水痘、带状疱疹→VZV 引起两种不同表现的疾病。
原发感染：水疱→小儿常见急性传染病
斑丘疹发展为水痘疹，同一部位可见到多种形式，即“多形性发疹”，向心性分布。
原发感染后长期潜伏于<u>脊髓神经后根神经节的神经元</u>内，再激活后引起带状疱疹。多见于成年人。
全球分布、冬春季流行，3~9岁好发。病人是唯一传染源。<u>呼吸道或直接接触</u>传播。
传染性：麻疹＞VZV＞风疹、腮腺炎
(一)病原
疱疹病毒科α-亚科，只有一个血清型。
体外抵抗力较弱、但在疱液中-65℃长期存活
不能在鸡胚和一般动物细胞中生长
(二)病原分离方法
<u>疱疹液</u>接种<u>人胚纤维瘤母细胞</u>，分离病毒颗粒。
产生局灶性CPE、细胞核内有嗜酸性包涵体、与邻近细胞融合呈多核巨细胞→非典型病例诊断
(三)特征性基因与抗原检测
- 抗原检测
ELISA、DFA法→抗VZV的特异性血清(or特异性单克隆抗体)→测VZV抗原 - 基因检测
PCR→特定基因
(四)抗体检测-临床常用
人群普遍易感、感染后获得持久免疫、儿童可产生永久性细胞免疫和体液免疫
VZV感染后产生IgM、IgG和IgA。
十八、手足口病
HFMD、柯萨奇A组16型(Cox A16)、肠道病毒71型(EV 71)
5岁以下婴幼儿、夏秋季常见
(一)病原
Cox A16、EV 71→小RNA病毒科肠道病毒属、二十面体、立体对称。
(二)病原分离方法
- 采集样本
- 粪便标本 越早越好，＜7 d。4~8℃运送、-20℃冻存
- 咽拭子 Hank液中、加塞
- 疱疹液 1ml注射器抽取、套上针套、冷藏运输
- 脑脊液 2~3ml CSF
- 尸检标本 中枢神经、降结肠(包括粪便)、冷藏
- 双份血 1 ml、不抗凝、间隔＞14 d
- 病原分离
细胞接种、乳鼠接种
人肺系细胞（MRC-5）分离Cox A16
其他人源细胞 wl-38、EK、横纹肌瘤细胞RD
(三)特征性基因与抗原检测
病毒培养分离、中和抗体检测、免疫组织化学法
<u>RT-PCR</u> 主要基于<u>Vp1、5‘UTR</u>设计引物
Vp1基因的原核表达产物作为抗原诊断Cox A16和EV 71感染。
<u>Vp1蛋白</u>作为检测抗原→检测IgGM、曾感染EV 71的IgG
