hello，大家好，今天我们要继续分享单细胞空间联合分析的部分，参考文章在High Resolution Single Cell Maps Reveals Distinct Cell Organization and Function Across Different Regions of the Human Intestine，运用单细胞空间的联合分析来解析人类的肠道，非常值得借鉴。

需要注意的分析内容

• 空间细胞密度
• 空间细胞“社区”，也就是细胞单元
• 单细胞与ATAC的联合分析
• 空间临近通讯分析
• 细胞类型的距离变化

Abstract

结肠是一个复杂的器官，可促进消化、提取营养、参与免疫监视、与微生物群保持重要的共生关系，并影响整体健康。为了更好地了解其在单细胞水平上的组织、功能和调节，研究对四个donors的八个不同肠道部位进行了 CODEX 多重成像，以及单核 RNA 和开放染色质分析。通过系统分析，发现不同肠道区域的细胞组成存在显着差异，证明上皮亚型的复杂性，并发现相同的细胞类型被组织成不同的邻域和群落，突出了肠道中存在的不同免疫生态位。研究还绘制了这些细胞中暗示调节分化级联的基因调控差异，并将肠道疾病遗传性与特定细胞类型相关联。这些结果描述了该器官细胞组成、调控和组织的复杂性，并作为了解人类生物学和疾病的重要参考图谱。

Introduction

成人肠道系统是一个复杂的器官系统，由大约 22 英尺的小肠和 7 英尺的大肠组成。 该系统完成了从口腔和胃开始的消化过程，首先在小肠中吸收水分和小分子营养物质（如糖类、单价离子和氨基酸），然后在大肠中积累较大的分子，如纤维， 充当厌氧发酵室，使这些复杂分子的进一步分解和吸收以及合成（通常通过消化道微生物群）和其他营养素（如维生素）的吸收。
小肠本身在表型上是异质的，由三个形态不同的区域组成：十二指肠、空肠和回肠。大肠同样可以划分为包括上升区、横向区、下降区和乙状区在内的区域。这些解剖区域中的每一个都包含表型和形态不同的细胞类型的巨大多样性。上皮细胞、基质细胞、神经细胞和免疫细胞，每一种都由多种细胞类型组成，分布在整个肠道中；免疫细胞尤其令人感兴趣，因为它们与肠道中存在的微生物组和外来物质相互作用。虽然这些广泛的细胞类型对肠道系统的所有部分都是常见的，但已知特定细胞类型的流行表现出位置差异：例如，已知潘氏细胞存在于小肠中，而肠内分泌 L 细胞主要存在于回肠和大肠中。此外，这些细胞类型在这些肠道区域中被空间组织成不同的“邻域”，这些邻域的组成和潜在细胞类型的分子表型在这些解剖区域以相对未知的方式变化。功能邻域的组成和构成这些邻域的细胞状态的分子特性的这些差异有望进一步揭示构建人类肠道的逻辑。
下面使用单核 RNA、开放染色质和空间蛋白质组学成像技术以单细胞分辨率绘制肠道的许多部分。以前的研究已经使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-Seq) 绘制了细胞类型图，并对整个肠道的细胞类型进行了表征。这里通过使用 CODEX（通过 indEXing 的 CODetection）对细胞和蛋白质进行空间映射来扩展这项工作，以在空间上表征大约 120 万个细胞，以及使用 snATACseq 对开放染色质进行单细胞分析来映射基因调控信息。分析定义了整个肠道不同细胞类型的相对丰度，包括
肠道不同区域上皮细胞的巨大复杂性，以及细胞组织成不同的多细胞结构壁龛。分析还绘制了这些细胞中的基因调控差异，暗示了调控分化级联。这些结果为了解这一复杂器官的细胞功能、调节和组织提供了重要见解，并为了解人类生物学和疾病提供了重要参考。

Results

Mapping the human intestine at single cell resolution

使用单核 RNA-Seq (snRNA-seq) 绘制了多个供体肠道中单细胞的细胞组成、调节信息和空间分布图，测量单个细胞核中的核 RNA 转录物，单核 ATAC-Seq (snATAC-seq)，测量单个细胞中的开放染色质，以及 CODEX，用多达 54 个针对不同蛋白质的抗体探针对同一组织切片进行染色。总共分析了四个人的八个部分。 年龄范围为 24 至 78 岁。 八个区域（从胃开始的轨迹顺序）是：十二指肠、近端空肠、中空肠和小肠回肠，以及大肠的升、横、降和乙状结肠区域。 The organs were procured from organ donors and were deemed to be of high quality by RNA quality measures。

CODEX Multiplexed Imaging of the Small Intestine and Colon

为了创建跨越八个不同区域的肠道空间图，使用了 CODEX 多路成像。 CODEX 数据保留了细胞类型的空间坐标，从而能够洞察细胞相互作用、多细胞组织单位的组成以及与肠道整体功能的空间关系。 这里首先针对一个受试者 (B001) 验证并优化了新鲜冷冻样品的 CODEX 染色、成像和图像处理。 将结肠和小肠的四个不同区域组合在同一张盖玻片上，以最大限度地减少批次效应。

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• 注：CODEX multiplexed imaging of 8 regions from the small intestine and colon to create a single-cell map of the healthy human intestine. A) Schematic for how CODEX multiplexed imaging was performed on arrays of 4 different sections of either colon and small intestine from the same donor simultaneously. Image processing steps done to extract single-cell spatial data

使用 44 个标记抗体panel染色并检测了大约 16 mm² 切片的免疫细胞、基质细胞和上皮细胞以及多细胞邻域。 确定了三种上皮细胞、六种免疫细胞和六种基质细胞类型——导致肠道特征的两种上皮细胞、三种免疫细胞和五种基质多细胞邻域.
已知上皮细胞亚型在空间上受到限制并且是肠道整体功能的关键； 因此，通过添加和验证 17 种肠道特异性标记物来扩展我们的 CODEX 抗体panel。 类似地使用此更新的 54 抗体盘对来自三个额外供体的八个区域样本进行了成像，这使得能够识别额外的 10 种细胞类型，例如 Paneth 和杯状细胞。 We propagated these cell type labels to two additional donors using the geometric deep learning method STELLAR that we developed for multiplexed spatial data.

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• 注：B) An example CODEX fluorescent image of one region of the small bowel (SB) for CODEX with 6/54 markers shown for one donor with C) accompanying cell type map following cell segmentation and unsupervised clustering.

使用这个结果数据集来比较不同组织区域的细胞组成和组织。 细胞类型由免疫、基质和上皮分组分隔，因为组织切片具有不均等的上皮或基质成分代表。

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• 注： Cell type percentages from CODEX data averaged across 3 donors stained with an updated CODEX antibody panel. Cell types are normalized by stromal, immune, and epithelial compartments. Asterix indicates p-value less than 0.05 difference in cell type percentage from the SB to the colon (CL)

观察到基质区室中细胞的表示没有统计差异，这里不希望在我们的细胞类型分辨率内看到血管化、神经支配或肌肉层的重大差异。 在免疫区室中，我们观察到从小肠到结肠的 CD8⁺ T 细胞减少，这与之前基于流式细胞术的观察结果一致。 类似地，我们观察到吸收性肠细胞减少，分泌性肠细胞（杯状细胞和未成熟的杯状细胞）增加，并且在从小肠移动到结肠时缺乏 Paneth 细胞。 小肠和结肠不同区域的细胞类型组成比不同供体（同一区域）的差异更大，providing confidence in the reproducibility of multiplexed imaging results.
细胞密度反映细胞是否在大范围内具有广泛的功能，是否在空间上受限于特定的功能，或者是否需要特定的细胞间相互作用。 此外，细胞密度的异常与炎症性肠病 (IBD) 等疾病状态有关。 由于肠道是体内最大的免疫器官，评估肠道中免疫细胞的定位和细胞相互作用对于理解口服疫苗设计、调节肠道微生物群的相互作用、调节过敏性食物反应、对伤口修复至关重要的轴和免疫系统至关重要。 癌症的系统反应和免疫疗法.
三种免疫细胞类型（CD4⁺ T、CD8⁺ T 和浆细胞）的检查显示细胞密度存在明显差异

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• 注： One representative cell type map with only plasma cells, CD4⁺ T cells, and CD8⁺ T cells shown。

目视检查表明，浆细胞具有最高的同种细胞类型密度，其次是 CD4⁺ T 细胞，然后是 CD8⁺ T 细胞，它们通过黏膜区域最广泛地扩散。 我们通过计算给定细胞类型与其相同细胞类型的五个最近邻居的平均距离并除以所有相同细胞在组织中均匀排列时的预期距离来量化这一观察结果。

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• 注：Quantification of the same-cell density that is measured as an average distance of its 5 nearest same-cell neighbors divided by the most diffuse same-cell distance.

因此，接近 1 的分数代表较低的相同细胞密度。 量化证实了我们的定性观察，表明浆细胞密度最高 (~0.2)，其次是 CD4+ T 细胞 (~0.3)，然后是 CD8+ T 细胞 (~0.37)。 CD4+ T 细胞的支持功能主要限于免疫细胞间相互作用，而对于 CD8+ T 细胞的免疫监视，我们预计分布会更广泛。 有趣的是，这些密度在相似细胞类型之间的肠道中很大程度上是保守的。 这些结果表明免疫细胞亚型沿肠道长度的空间限制的重要作用。

Multicellular Neighborhood Analysis of the Intestine

为了提供有关肠道细胞间相互作用、细胞密度和整体多细胞结构的全局视图，我们进行了细胞邻域分析 。 简而言之，该分析涉及 (i) taking windows of cells across the entire cell type map of a tissue with each cell as the center of a window, (ii) calculating the percentage of each cell type within this window, (iii) clustering these vectors, and (iv) assigning overall structure based on the average composition of the cluster。 对肠道 CODEX 数据的细胞邻域分析揭示了 18 个重要的多细胞结构，具有主要的上皮、基质和基于免疫的邻域。

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• 注：Multicellular neighborhood analysis of intestine. A) Neighborhood analysis was done by taking a window across cell type maps and vectorizing the percentage of cell types in each window, clustering windows, and assigning clusters as cellular neighborhoods of the intestine. B) 18 unique intestinal multicellular neighborhoods (y axis of heatmap) were defined by enriched cell types (x axis of heatmap) as compared to overall percentage of cell types in the samples。

与观察到的浆细胞相同细胞密度高一致，我们观察到浆细胞密度增加驱动的浆细胞富集邻域。 这种富含浆细胞的邻域还表现出 CD4+ T 细胞和抗原呈递细胞（如树突细胞和巨噬细胞）的共同富集。 这些观察结果与最近的工作一致，表明 CD28 与骨髓内抗原呈递细胞的浆细胞结合可以维持在血浆特异性壁龛中的长期存活。 此外，抗原呈递细胞是 APRIL 的来源，在炎症的情况下，APRIL 会促进异位生发中心的形成和浆细胞浸润。 总的来说，这些观察结果表明抗原呈递细胞在管理肠道浆细胞的上皮下生态位中的作用。

有趣的是，尽管与肠道中的其他细胞相比，CD8+ T 细胞的相同细胞密度较低，但 CD8+ T 细胞在两个主要区域中得到保守和富集。这些邻域之一（CD8+ T 富集的 IEL）表现出上皮细胞类型和 CD8+ T 细胞的富集。这些 CD8+ T 细胞通常被称为上皮内淋巴细胞 (IEL)，它们是“前线士兵”，对于快速免疫反应、防止感染（通过 MHCI 结合和细胞毒性）和维持上皮完整性（通过调节）至关重要上皮细胞增殖）。这些细胞的失调与 IBD 和乳糜泻有关。然而，由于分离这些 T 细胞的挑战，它们一直难以研究。这个富含 CD8+ T 的 IEL 社区是少数几个从小肠 (~30%) 到结肠 (~3%) 流行率发生变化的社区之一。这种变化可能反映了抗原暴露的差异，因为小肠中的细胞暴露于膳食抗原的次数增加，而结肠中的细胞可能更多地暴露于肠道微生物群。

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• 注：an example of where neighborhoods are mapped back to the tissue to show overall tissue structures.

CD4+ T 细胞有助于肠道的 5 个不同的多细胞邻域，包括内滤泡、先天免疫富集、浆细胞富集、适应性免疫富集和外滤泡。鉴于 CD4+ T 细胞协调先天性和适应性免疫反应，这种广泛的社区成员资格是合适的。 CD4+ T 细胞、B 细胞和 DC（树突细胞）成员定义了两种不同的基于滤泡的结构。这些结构中的第一个存在于毛囊的外部区域，表现出更高的 CD4+ T 细胞富集，而毛囊的内部区域则富集了 B 细胞。内滤泡（即生发中心）邻域的存在取决于完全成熟的淋巴滤泡，如图像中的 Peyer 斑块。然而，外卵泡邻域在整个肠道中是恒定的，并由富含外卵泡邻域的 B 细胞、DC 和 CD4+ T 细胞定义，与内卵泡结构相比。这些数据与之前定义肠道内淋巴组织连续体的工作一致，其中较小的结构（如隐斑）有可能发展成较大的卵泡，尤其是在炎症的情况下

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先前的研究还表明，小肠与结肠的淋巴滤泡发育存在差异。 通过比较小肠和结肠中的外滤泡邻近细胞类型组成，我们观察到，虽然两者都是由 CD4+ T 细胞的富集驱动的，但结肠的 B 细胞和 DC 的富集程度更高，而小肠则富集了 用于 CD8+ T 细胞、神经和浆细胞。 这种结构相似性由邻域分析识别，但也可以识别这些相似邻域内细胞组成的主要差异。

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• 注：Heatmap of enriched cell types for just the outer follicle neighborhood compared between SB and CL

我们接下来比较了小肠和结肠中所有邻域组成的relative fold enrichment ，以创建邻域差异的热图。该热图根据邻域和细胞类型类别中的最大总差异进行排名，表明整个肠道具有最大保守性的邻域，以及跨邻域最保守的细胞类型。整个肠道的多细胞结构保守表明一组细胞类型具有所需的功能，而较少的保守表明核心功能以及基于解剖位置的组成灵活性的需要。我们发现内部和外部卵泡结构都不太保守，而基质邻域则更加保守。我们还观察到早期分泌上皮邻域，在小肠中而不是在结肠中包含潘氏细胞，是最不保守的邻域——表明整个肠道有不同的隐窝微环境

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• 注：Difference in composition in neighborhood by cell type for all neighborhoods based on subtracting the fold enrichment in SB from CL.

Hierarchical Structural Analysis of Intestine and Mucosal Epithelial Compartment

多细胞邻域分析揭示了整个肠道的结构组成以及这些邻域的组成的关键差异。 然而，这项分析并没有揭示这些多细胞邻域如何相互作用，或者它们在组织中的空间结构如何。 了解多细胞群之间的关系是定义组织组织层次和定义关键功能组织界面的关键。

使用多种方法研究了高阶结构组织。 首先，我们以类似于我们从细胞类型定义邻域的方法的方式对邻域组合的windows进行聚类； 这产生了社区和社区的主要社区this generated and major of neighborhoods，并揭示了肠道的空间分层，从平滑肌、基质和上皮区域内移动。 有趣的是，比较小肠和结肠之间免疫主要群落的定位显示，与位于顶点的大肠相比，定位于上皮底部的差异定位可能反映了不同的微生物负荷。 此外，细胞邻域向量的 tSNE 表示概括了整个组织结构； 例如，主要的社区地图显示平滑肌和间质邻域非常接近，与位于上皮结构之间的免疫邻域相邻
为了将空间组织的各个层次相互联系起来，我们创建了一个层次结构网络图

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• 注：Multi-level hierarchical structural description of small intestine and colon. A) Representation of multiple levels of hierarchical description: i) cell type, ii) multicellular neighborhood, iii) community (based on clustering windows of cell neighborhoods), and iv) major community (major types of communities) compared for the small bowel (SB) to the colon (CL). B) tSNE of neighborhood vectors with neighborhood, community, and major community labels projected. C) Graph of multi-level structure of the tissue as broken down by the different structures. Shapes correspond to structural level, colors represent individual categories, size of shapes represents the percent contribution to tissue, and the size of connected lines represents the overall contribution to the next level of structure as moving down the graph in increasing tissue structural hierarchy.

上图C的每一层都通过其对这些高阶结构的主要贡献者连接到下一层。使用这种直观的intuitive formalism，我们观察到基质细胞和平滑肌细胞类型和结构之间的串扰，这些细胞类型和结构又与上皮细胞和免疫成分分离，这些成分彼此更加缠绕。此外，上皮和免疫起源的主要社区在各个级别的组成上更加多样化。使用这种图结构，我们还可以观察结构之间的多层次关系。例如， 是多个社区的重要交叉点：proliferating transit amplifying zone,secretory epithelial, adaptive immune enriched, outer follicle, and innate immune enriched。因此，这表明这些重要的免疫富集区尚未成为更大的结构化免疫卵泡，它们在肠道分泌和转运放大区的两侧具有专门的壁龛。
利用这种组织组织的分层解构来检查多细胞邻域中的相互作用。 我们分离了由主要上皮和免疫组织社区定义的细胞，并使用与我们的邻域分析类似的原理来提取交互信息。 我们根据每个窗口中邻域的百分比量化了邻域图中的窗口组成。 然后，我们不是对窗口组合向量进行聚类，而是评估哪个邻域组合至少占每个窗口中 85% 的邻域，总结独特的邻域组合，并将这些结构相互作用连接到小肠和结肠的网络图结构中.

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• 注：Spatial context maps of SB and CL highlighting relationships of multicellular neighborhoods. This structure is defined by the number of unique neighborhoods required to make up at least 85% in a given window. This graph was constructed from only the epithelial and immune regions as defined by the major community labels of cells. Circles represent the number of cells represented by a given structure.

从该分析中，已经注意到的组成差异很明显，其中成熟上皮和富含 CD8+ T 的 IEL 邻域组合存在于小肠中，但不存在于结肠中。在结肠中，早期分泌上皮区与其他几个区相结合，包括增殖转运放大区和浆细胞富集区。此外，浆细胞富集邻域与许多邻域相连，但通常与适应性免疫富集邻域共同富集，小肠图和结肠图也共享该邻域。从高分辨率图像中粘膜区域的邻域顺序也可以看出浆细胞富集邻域的互连性。早期分泌和适应性免疫区在隐窝底部富集，然后分泌细胞和浆细胞通过隐窝中部富集，然后是先天免疫和成熟上皮区。总之，分层映射数据进一步证实了小肠和结肠之间多细胞结构的组成差异，但也突出了保守的多细胞结构相互作用和不同细胞类型在肠道亚区的重要分布。

Single-cell transcriptomic and chromatin analyses reveal cell composition differences across regions of the intestine

CODEX 揭示了细胞的不同组成及其在不同肠道区域的排列。 然而，CODEX 实验仅包括 54 个探针，可能限制了可识别的细胞类型的数量和复杂性以及它们在肠道不同区域的分布。 为了克服这些限制并创建人类肠道的基因调控图谱，我们在四个供体的八个肠道区域上生成了 156,119 个 snRNA-seq 和 153,997 个 snATAC-seq profiles 。

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• 注：Single-cell atlas of gene expression and chromatin accessibility in the human intestine. A) Sections of the intestine from which cells were isolated for snRNA-seq and snATACseq

为了检查肠道区域之间的整体差异，我们首先将来自肠道所有区域的细胞聚集在一起，发现来自所有区域的免疫细胞和基质细胞聚集在一起，而上皮细胞根据它们是从 1) 十二指肠或空肠中分离出来而分离，2 ) 回肠，或 3) 结肠。 我们接下来对来自肠道不同区域的免疫细胞、基质细胞和上皮细胞进行亚群，揭示了总共 7 种免疫细胞、13 种基质细胞和 18 种上皮细胞类型。 通过检查已知标记基因的基因表达水平和基因活性评分以及使用先前发布的 scRNA-seq 数据标记数据集来注释细胞类型

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• 注： B) UMAP representation of all cells colored by the region of the intestine that they were isolated from as indicated in A. C, D) UMAP representation of all stromal (C) and immune (D) cells colored by cell type. E) Stacked bar plot representation of the fraction of total immune (top) and stromal (bottom) cells isolated from each region consisting of each cell type. F) UMAP representation of epithelial cells in the 4 primary regions of the intestine. Jejunum includes both proximal- and mid-jejunum samples. Colon includes samples from ascending, transverse, descending, and sigmoid colon. For all UMAP representations, snRNA is on the top and snATAC is on the bottom

在免疫区室中，我们确定了 CD4+ 和 CD8+ T 细胞（CD2、CD3E、IL7R、CD4、CD8）、B 细胞（PAX5、MS4A1、CD19）、浆细胞（IGLL5、AMPD1）、NK 细胞（SH2D1B）、snRNA 和 snATAC 数据集中的巨噬细胞/单核细胞 (CD14) 和肥大细胞（HDC、GATA2、TPSAB1）。 来自一个供体的 NK 和 T 细胞与 snRNA 数据中的其他 T 细胞分开聚集，这可能是因为该供体比本研究中的其他供体年轻得多（24 岁）。 大多数免疫细胞类型都在单核数据和 CODEX 数据中被识别，除了肥大细胞仅在单核数据中被识别，树突细胞和中性粒细胞仅在 CODEX 数据中被发现 . 与 CODEX 实验的结果相似，一些免疫细胞类型在肠道中的含量不同。 例如，T 细胞在小肠中更普遍，而 B 细胞和巨噬细胞/单核细胞在结肠中更常见.
在基质隔室中，我们注释了八种成纤维细胞亚型、神经胶质细胞、神经元和内皮细胞。 MYH11 和 ACTA2 高表达的细胞被归类为平滑肌/肌成纤维细胞。 我们还鉴定了具有高水平 WNT 激动剂的成纤维细胞，例如被认为存在于隐窝中的 RSPO3，以及具有高表达 WNT5B 和 BMP 转录物的成纤维细胞被认为存在于绒毛中。 与免疫细胞类似，我们观察到了肠道细胞类型丰度的变化。 例如，平滑肌/肌成纤维细胞在十二指肠和空肠中含量最少，在回肠中含量中等，在结肠中含量最高。 相反，绒毛成纤维细胞和内皮细胞表现出相反的趋势； 它们在十二指肠和空肠中含量最高，在回肠中含量较低，在结肠的四个区域中含量最少.

鉴于上皮细胞最初是根据位置聚集在一起的，我们分别对来自不同主要位置（十二指肠、空肠、回肠和结肠）的上皮细胞进行亚聚类和注释。 在注释细胞时，我们观察到不同肠道区域内的相似细胞类型。 例如，从干细胞到成熟吸收细胞（肠细胞）的分化轨迹在所有区域都很明显。 我们将此分化轨迹划分为先前在其他研究中定义的五种细胞类型（Stem>TA2>TA1>Imature Enterocyte>Enterocyte）。然而，我们观察到这些细胞沿连续体存在，因此细胞类型的确切数量和位置 细胞类型之间的划分在某种程度上是任意的，并且在聚类过程中改变分辨率会导致沿着这条轨迹出现更多或更少的聚类。除了 absorptive cells收细胞吸外，我们还在肠道的所有区域观察到了杯状细胞、Best4+ 肠细胞、簇状细胞和肠内分泌细胞，尽管在小肠中观察到的肠内分泌细胞具有更大的多样性，其中观察到多个离散的cluster.正如预期的那样，与 CODEX 结果一致，在小肠的所有区域都观察到了潘氏细胞，但在结肠中没有发现。最后，十二指肠包含两个在 snRNA 中鉴定的额外cluster和一个在 snATAC 数据集中鉴定的cluster。这些细胞与吸收细胞类型分开聚集，我们发现 kegg 途径粘蛋白型 O-聚糖生物合成富含这些细胞类型之一的标记基因。在检查这些cluster中的特定标记基因时，我们发现一个cluster高表达 MUC5B，另一个cluster高表达 MUC6 和 TFF2，表明这些可能是不同类型的粘蛋白产生细胞，其中 MUC6+ 细胞可能代表这些细胞布伦纳氏腺.

为了进一步探索人体肠道中肠内分泌细胞的多样性，我们对来自肠道所有区域的肠内分泌细胞进行了subclustered，并根据肠内分泌标记基因的表达对cluster进行了注释。我们鉴定了许多已知的肠内分泌细胞亚型，包括 D 细胞（SST 高）、I 细胞（CCK 高）、K 细胞（GIP 高）、Mo 细胞（MLN 高）、S 细胞（SCT 高）和 L 细胞（PYY 高） ）。然而，我们还鉴定了多个肠嗜铬细胞cluster，它们表达 TPH1，一种参与血清素合成的酶。有一cluster肠内分泌细胞不表达任何这些特定标记，我们在subcluster数据集中将其标记为肠内分泌。 L 细胞形成两个不同的cluster，其中一个具有高表达的 INSL5，我们将其标记为 INSL5+ L 细胞。十二指肠中肠内分泌和肠嗜铬细胞的绝对数量最高，其次是空肠。我们观察到沿着肠道的每个亚型肠内分泌细胞的比例发生了巨大变化。例如，正如先前研究所预期的那样，表达 SST 的 D 细胞在十二指肠中最为丰富。在结肠中，肠嗜铬细胞和 L 细胞最为丰富，沿结肠长度观察到一些变化，包括远端结肠中 INSL5+ L 细胞的增加。这些结果提供了关于肠内分泌和肠嗜铬细胞复杂性的非凡细节，可能定义了新的肠嗜铬细胞亚型，并描述了它们的种群如何沿肠道长度变化

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• 注： Regulatory transcription factors in the human intestine. A) Sub-clustering of enteroendocrine cells from all regions of the intestine. Cells are colored by cell types as defined in B. B) Fraction of all enteroendocrine cells in each region of the small intestine and colon made up of each enteroendocrine/enterochromaffin subtype.

Nominating Specific Molecular Interactions in Neighboring Cells

CODEX 数据支持分配相邻细胞类型，snRNA-Seq 数据提供了在这些细胞中 RNA 水平表达的分子的描述。 通过结合这两种数据类型，我们可以指定可能促进这些细胞类型的细胞间通讯的潜在配体受体对。
使用colocalization quotient来衡量细胞类型 A 优先与细胞类型 B 相关的程度。我们确定了显着的成对细胞类型共定位，并专注于小肠和结肠之间显着不同的那些。 该分析确定了八种细胞类型对，它们在结肠中比小肠中更共定位； 六对涉及肠细胞、浆细胞、TA 和平滑肌。 涉及浆细胞的细胞类型对在降乙状结肠组织切片中比在其他切片中更集中

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使用来自这六种细胞类型的 snRNA-Seq 数据，我们对配体和受体进行了差异表达分析，并确定了 48 对在结肠中比在小肠中表达更多的配体和受体。 例如，我们发现配体 SEMA4D 和受体 MET 在结肠组织中的浆细胞和 TA2 中分别上调

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• 注：SEMA4D ligand expression in plasma cells and MET receptor gene expression in TA2 cells, showing higher expression in colon than small bowel.

这在小肠中未观察到，并且在所有细胞类型对中仅以 4.1% 的比例表达。 SEMA4D 信号传导与多种免疫疾病有关，并在细胞间通讯中发挥重要作用，特别是在 B 细胞聚集和长期存活中。与小肠中的 TA2 细胞相比，MET 受体对结肠中 TA2 细胞的影响进一步通过（i）对 MET 激活（包括 RAS 和 MAPK 信号传导）的下游反应的富集，以及（ii）已知的丛蛋白上调得到证实与信号素的高亲和力相互作用并激活 MET。这种可能的相互作用与之前对不同浆细胞富集多细胞邻域的 CODEX 多路复用成像数据的表征、整个肠道的浆细胞富集邻域的保护以及这些邻域比较小肠和结肠的差异连接的特征一致。因此，这表明维持结肠中富含浆细胞的邻域存在潜在的差异存活信号。总体而言，这些结果确定了潜在的配体-受体相互作用，这些相互作用介导了肠道不同区域的特定细胞类型相互作用，并为其他将空间多路复用成像数据与成对 snRNAseq 分析相结合的图谱工作提供了模板。

Integration of snRNA and snATAC data nominates transcription factors regulating gene expression in different cell types

为了深入了解控制肠道分化的因素和事件，我们接下来研究了调节不同肠道细胞类型基因表达的潜在转录因子 (TF)。我们首先计算了数据集中每个细胞的 ChromVar 偏差分数 41，这使我们能够识别与不同细胞类型中染色质可及性相关的 TF 基序。由于许多 TF 具有相似的基序，因此结合基序活性检查 TF 表达有助于识别在不同肠细胞类型中起作用的特定 TF。为了检查 TF 表达，我们使用典型相关分析整合了 snRNA 和 snATAC 数据以对齐数据集并将 snRNA 数据分配给每个 snATAC 细胞。我们接下来确定了在其基因表达与其假定的 DNA 结合基序的染色质可及性活动水平之间具有最高相关性的 TF，以提名直接驱动可及性变化的 TF。在整个肠道中，该分析揭示了 63 个具有与表达密切相关的基序活性的 TF（r>0.6）。从广义上讲，我们观察到在分泌谱系中活跃的 TF 和在吸收谱系中活跃的 TF，具有相对较小的子集参与两者的 TF（例如结肠肠细胞中的 KLF4 和 ELF3 和整个肠道的杯状细胞）。

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• 注：) Heatmap representation of transcription factors whose integrated gene expression was correlated with their motif activity in one region of the intestine. Row z-scores of ChromVar deviation scores are shown on the left and row z-scores of integrated TF expression are shown on the left.

该分析突出了许多已知在肠道中发挥重要作用的 TF。例如，ASCL2，一种肠道干细胞的主要调节因子，在干细胞中表现出其基序的高表达和可及性。在干细胞中具有高表达和基序活性的其他 TF 包括 NFIX、NFIA、NFIC 和 HNF1B。在分泌谱系中，POU2F3 是小鼠簇状细胞发育所必需的调节剂，在整个人类肠道的簇状细胞中高度表达并具有高基序活性。与 POU2F3 一起，RUNX1 和 RUNX2 在整个肠道的簇状细胞中也表现出高表达和可接近性。在杯状细胞中，KLF4 是小鼠终末分化为结肠杯状细胞所必需的，表现出高基因表达和基序活性。令人惊讶的是，KLF4 的表达和基序活性在结肠中分化的吸收性上皮细胞（未成熟的肠上皮细胞和肠上皮细胞）中也很高，但在肠道的其他区域则不然，表明位置特异性调节。在肠内分泌/肠嗜铬细胞中，LMX1A、LMX1B、RFX2、RFX3 和 RFX6 表现出高表达和可及性。其中，LMX1A 已被提议作为肠嗜铬谱系的调节剂，并且是 TPH1（一种参与血清素合成的酶）的调节剂。当我们检查 LMX1A 在肠内分泌和肠嗜铬亚型中的表达时，我们观察到它仅在肠嗜铬蛋白细胞。类似地，RFX6 是一种建议的肠内分泌细胞分化调节剂，RFX6 的缺失会损害小鼠的肠内分泌细胞分化。总之，这些结果支持了先前的发现，并提名了额外的 TF，这些 TF 可能是不同肠道细胞类型的重要调节因子，这些细胞类型在肠道的不同区域（例如 KLF4）可能有所不同。

Differentiation trajectories across the intestine reveal distinct gene regulation programs

肠道干细胞不断分化为成熟的肠细胞、杯状细胞和其他特殊细胞类型，如肠内分泌、簇状细胞和窗格细胞，大约每 3 到 7 天更新一次上皮内层。为了绘制伴随干细胞分化为成熟肠细胞的调控和基因表达变化，我们在来自十二指肠、空肠、回肠和结肠的单核数据中沿着这条途径定义了分化轨迹。然后，我们在这四种分化轨迹中的任何一种中确定了可变染色质可及性（“peak值”）和可变基因表达的区域。该分析揭示了肠道不同区域发育假时间中相关基因表达和可及性变化的连续轨迹。例如，编码在十二指肠中将胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶的蛋白质的 TMPRSS15 在十二指肠中高度表达，在更分化的细胞中其表达逐渐增加。我们接下来将这些可变peak和基因聚类以识别具有共同行为的集合，揭示在肠道所有区域的分化假时间（例如在干细胞中）早期开放和表达的peak和基因组，我们将其表示为早期(E)。该cluste’包括肠道干细胞的一般标记物，包括在整个肠道中共享的 RGMB、SOX9、SMOC2 和 LGR5。其他基因cluster和peak包括主要存在于未分化十二指肠和空肠（例如 REG3A、SCTR）、分化小肠细胞（例如 MTTP、APOA4、APOC3、MME）、未分化结肠（例如 ROR2、PTGDR）和分化的结肠（例如 SCNN1B51、P3H2、MS4A12）。

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• 注：Regulation of differentiation in the human intestine A) UMAPs depicting the cells in the four primary regions of the intestine (duodenum, jejunum, ileum, and colon), labeled by cell type (left) and differentiation pseudotime (right). B, C) Variable peaks (B) and genes (C) identified along the absorptive differentiation trajectories. The rows represent the row z-scores of accessibility for each peak or expression for each gene. Columns represent the position in the pseudotime from start to end for each section of the intestine. Peaks and genes are k-means clustered and the clusters are labeled based on the dominant time and location where they are most accessible/expressed.

为了识别cluster特异性调控的染色质驱动因素以及相关的cluster特异性基因表达程序，我们计算了每个 peak cluster中的 TF 基序富集和每个基因cluster中的 KEGG 通路富集。 在分化轨迹后期可到达的peak组富含 HNF4 和 JUN/FOS 基序。 正如预期的那样，主要在小肠分化轨迹后期表达的基因（十二指肠空肠晚期cluster）富集了多种代谢 KEGG 途径，包括脂肪消化和吸收和蛋白质消化和吸收。

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• 注：D) Hypergeometric enrichment of motifs in the clusters of peaks identified in B. E) Enrichment of KEGG pathways in the clusters of genes identified in C.

我们接下来通过计算四个分化轨迹中每个细胞的 TF 表达和 ChromVar 偏差之间的相关性，确定了其基因表达与其基序活性相关的 TF。我们发现了 68 个 TF，其表达与其基序活性相关 (r>0.7)，并绘制了这些转录因子的整合基因表达。许多这些因素在所有四个分化轨迹上都表现出类似的活动。例如，ASCL2 是肠道干细胞的主要调节因子，在所有四个轨迹的开始处都高度表达。其他 TF，如 ETV6，在肠道的不同区域表现出不同的行为。 ETV6 是一种转录因子，与正常结肠相比，在结直肠癌中表达减少，ETV6 的遗传变异可能赋予结直肠癌易感性。我们发现 ETV6 在结肠中的表达比在小肠中更高，并且与小肠不同，ETV6 在结肠中更多分化的细胞中表达增加。

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• 注：Integrated gene expression of TFs whose gene expression is correlated with ChromVar motif activity along the differentiation trajectory.

作为检查如何控制具有独特表达模式的基因的一个例子，我们接下来测试了哪些调控元件可能导致 ETV6 在肠道不同区域的这种可变表达。我们确定了与肠道任何区域中 ETV6 表达相关的可及性peak，然后绘制了这些peak的可及性如何沿每个区域的分化假时间变化。对于七个最相关的peak，可接近性往往在结肠中最高，在那里表达最大。在肠道的其他区域（内含子 3）中最容易接近的peak值沿着分化轨迹变得更难接近，这与这些区域中沿着分化假时间的表达降低一致。在结肠中也观察到类似的行为，尽管结肠中 ETV6 的表达增加，但沿分化轨迹的 Intronic 3 peak变得更难接近。然而，多个其他peak，包括远端和内含子，仅在结肠中的分化程度更高的细胞中表现出增加的可及性，我们推测这些调控元件可能会推动 ETV6 在分化的结肠细胞中的表达增加。可以应用相同的逻辑来识别可能驱动整个肠道基因表达变化的调控元件。例如，我们确定了 4 个与 TMPRSS15 表达高度相关的peak，并可能推动其在十二指肠中的表达增加。综上所述，该分析为干细胞在肠道内对肠上皮细胞分化的调控提供了参考。

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• 注：Accessibility at peaks correlated with the expression of ETV6 along the differentiation trajectory in each region is plotted on the left. Each peak is normalized to the maximum accessibility along any of the trajectories. Integrated gene expression of ETV6 along the differentiation trajectory in each region is plotted on the right.

我们接下来使用linkage disequilibrium（LD）评分回归测试了疾病遗传力是否在肠细胞类型中的细胞类型特异性标记物peak中富集。 我们发现克罗恩病和乳糜泻的 T 细胞标志物peak的遗传力显着增加，这与 T 细胞在其发病机制中的重要性一致。 我们观察到肠内分泌细胞中 BMI 遗传力的最显着富集，表明遗传变异可能对肠内分泌细胞产生影响，从而导致对 BMI 的影响。 作为对照，我们还测试了 GWAS SNP 的遗传力是否在无关性状（龋齿）中富集，并且没有发现细胞类型特异性富集。 这些结果将重要的疾病特征映射到肠道中的特定细胞类型。

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• 注：LD Score Regression to identify enrichment of GWAS SNPs in cell-type specific marker peaks. Unadjusted p-values are plotted in the heatmap. Significance is indicated by an asterisk in each box, as determined by a Bonferroni-corrected p-value of less than 0.05. P-values for determining significance were adjusted for the number of cell classes tested。

Discussion

我们使用各种不同的单细胞（CODEX、snRNA-Seq、snATAC-Seq）技术以高分辨率分析了肠道的许多不同区域。 我们的工作通过结合空间蛋白质组学数据集（CODEX 成像）以及 snRNA 和 snATAC 技术，极大地扩展了以前的单细胞研究。 我们证明了小肠广泛的细胞复杂性，包括相当大的上皮异质性和新的分泌细胞亚型，肠道的不同区域具有不同的细胞组成，并且细胞被组织成不同的邻域，这些邻域也形成社区。 我们还展示了肠道内这些社区和社区的保护性和异质性。 最后，还绘制了开放染色质调节程序，定义了在肠道不同区域使用的关键调节剂和分化途径。

我们生成了肠道的空间分层描述，该描述源自我们在 CODEX 多路复用成像数据中生成的细胞类型标签。通过检查十个最近邻细胞内的保守细胞类型组成，我们计算的第一层是组织内的直接细胞邻域。这些代表并确定了在肠道内发现的微结构，例如脉管系统或免疫卵泡。我们进一步建立在邻域概念的基础上，以了解细胞的邻域如何相互作用并趋于共定位。我们在多细胞结构群落中对这些进行了定量表征，这些群落可以进一步分为主要群落类型。虽然小肠和结肠之间共享相同的主要群落，但我们观察到免疫群落的差异定位，这些免疫群落定位于结肠的顶点和小肠的上皮细胞的底部，这可能反映了不同的微生物负荷。这种分类分离了富含免疫细胞和上皮细胞的组织的粘膜区域，并在比较结肠和小肠时定义了多细胞邻域的整体结构和相互作用。这种多路复用空间数据的分层视图可以作为其他空间图集工作的模板参考。

我们将空间分析重点放在肠道内的免疫细胞组织上，因为浆细胞、CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞都在肠道免疫反应中发挥着关键作用。浆细胞通过分泌 IgA 抗体在免疫中发挥重要作用，IgA 抗体是产生最多的抗体，对于维持与微生物群和食物抗原的稳态关系至关重要。有趣的是，浆细胞具有最高的相同细胞密度，并且还发现与抗原呈递细胞共同定位在这个在肠道所有区域中发现的多细胞邻域中。通过合并 snRNAseq 数据和 CODEX 数据，我们还发现浆细胞和转运放大上皮细胞是在结肠中比在小肠中更多地共定位的细胞对之一，并且差异表达的 SEMAD-MET 配体对已知可诱导 B细胞聚类。浆细胞需要一个特殊的生态位才能在骨髓中存活，并具有 CD44、增殖诱导配体 (APRIL)、IL-6 和 SDF-1 等存活因子。浆细胞的定位在上皮下空间的肠道相关淋巴组织 (GALT) 中对于 IgA 通过上皮的转胞吞至关重要，我们发现富含浆细胞的邻域形成了粘膜内其他几个免疫和上皮邻域的重要十字路口。因此，我们的数据表明，来自结肠的抗原呈递细胞和转运放大细胞在维持连接其他多细胞免疫和上皮结构的粘膜丰富的浆细胞区方面发挥着关键作用。

CD4+ T 细胞参与 B 细胞的 CD4+ T 细胞支持和 CD8+ T 细胞的激活。我们发现 CD4+ T 细胞广泛分布并富集在所有富含免疫的多细胞结构（先天免疫富集、内卵泡、外卵泡、适应性免疫富集和浆细胞富集）中，这些结构具有支持功能的特征。特别是，CD4+ T 细胞是外卵泡多细胞邻域中最丰富的细胞类型，无论是否存在完全发育的卵泡结构，它都存在于肠道的所有部位。这一观察结果表明，免疫系统似乎在结构上沿着肠道保持平衡，以根据需要在局部产生以生发中心为重点的免疫反应。将小肠与结肠进行比较时，滤泡型多细胞结构是最不保守的结构之一。进一步了解这些差异对于阐明功能差异、发育和维持很重要，因为卵泡与有益的癌症结果、增强的自身免疫和清除感染有关。此外，CD4+ T 细胞广泛参与多种免疫多细胞结构表明它们的调节可能是调节肠道免疫反应的关键治疗靶点。

CD8+ T 细胞对于抗病毒细胞毒功能至关重要，是 CODEX 数据中定义的少数细胞类型之一，显示从小肠到结肠减少。这种成分变化可能反映了抗原可用性的差异，与最初接触以及与结肠相比，更多地接触食物抗原和具有较少粘液分泌细胞的异物。这些差异被分为两个邻域，即富含 CD8+ T 的 IEL 和适应性免疫，其中富含 CD8+ T 的 IEL 邻域在结肠中几乎耗尽。这种结构差异进一步证实了 IEL CD8+ T 细胞与肠道内其他 CD8+ T 细胞的表型区别，值得进一步研究以了解这些细胞的维持、调节和更新。事实上，CD8+ T 细胞的存在和密度与有益的抗癌结果相关，与小肠相比，结肠内的癌症发病率增加。未来探索这种相关性并了解上皮内免疫细胞是否有助于去除有缺陷的上皮细胞将是很有趣的。

我们还计算了从小肠到结肠的多细胞结构的相似性，并生成了一个保守分数来描述组成的相似性。 从该分析中可以明显看出，所有多细胞结构都检测到该结构的共同核心特征，例如外滤泡结构中 CD4+ T 细胞的高富集，但其他细胞类型的组成富集有所不同。 最多样化的结构是早期分泌上皮多细胞邻域。 这进一步证实了隐窝结构是小肠和结肠之间差异功能的关键调节因子，并与从 RNA 和 ATAC 数据集观察到的差异一致。

利用成对的转录组和染色质可及性数据，我们实现了进一步的粒度来定义肠道中细胞类型的多样性。总的来说，结肠的不同区域表现出高度一致的细胞类型丰度。然而，与结肠相比，小肠区域的细胞类型组成更加多样化，回肠通常表现出小肠区域和结肠之间共享的免疫和基质细胞类型部分。我们观察到特化上皮细胞的多样性更大，包括小肠中的肠内分泌和粘液分泌细胞。在所有区域内，我们鉴定了具有高表达 MUC2 的杯状细胞。然而，在十二指肠中，我们发现了两个额外的细胞cluster，其特征是形成凝胶的粘蛋白 MUC5B 和 MUC6 的高表达。 MUC6 cluster可能代表十二指肠 Brunner 腺体的细胞，这些细胞已被证明表达高水平的 MUC6。 MUC5B cluster更令人惊讶，因为已知 MUC5B 在肺和胆囊的杯状细胞中表达，在结肠杯状细胞中表达水平较低，但在十二指肠中不表达，其中 MUC2 和 MUC6 是主要的粘蛋白。

虽然之前的 scRNA 数据集已经检查了人类肠道中细胞类型的多样性，但我们集成的 snRNA 和 snATAC 数据集提供了详细的肠道单细胞调控图。 我们使用这个数据集来识别不同细胞类型中的转录因子，这些细胞类型的基因表达与它们结合的基序的可及性高度相关。 这确定了已知是不同细胞类型的主要调节因子的 TF，包括 Tuft 细胞中的 POU2F3、干细胞中的 ASCL2 和肠内分泌细胞中的 RFX6，同时还指定了许多其他转录因子，这些因子可能是各自细胞类型中的重要调节因子。 这包括簇状细胞中的 RUNX1 和 RUNX2、杯状细胞中的 FOXA3 和 ATOH1 以及潘氏细胞中的 ZBTB18。

在肠道的所有区域内，肠道干细胞分化为成熟的吸收性肠细胞。通过沿着肠道不同区域的分化轨迹整合基因表达和染色质可及性数据，我们指定了在肠道所有区域的吸收分化中表现出一致行为的 TF。其中有已知的肠道干细胞调节剂，如 SOX9 和 ASCL2，它们在肠道所有区域的分化轨迹开始时高度表达并在细胞中具有高染色质活性。我们还观察到不同区域轨迹之间 TF 动力学的许多差异。一个这样的例子是 ETV6，它在结肠的分化吸收细胞中高度表达，但在肠道的其他区域不表达。有趣的是，在 CRC 中 ETV6 表达降低，并且 ETV6 中的遗传变异可能赋予 CRC 风险。我们的数据使我们能够推测为什么会出现这种情况，因为 ETV6 对正常结肠分化很重要，因此 ETV6 的缺失可能会阻止结肠干细胞的分化。检查这些数据还使我们能够将特定的调控元件与沿轨迹的转录因子的表达联系起来。对于 ETV6，该分析确定了一个远端和三个具有相似活性的内含子调控元件，它们最有可能负责沿结肠中的吸收分化轨迹驱动 ETV6 的表达。

染色质可及性数据还允许使用与常见肠道疾病（例如 GWAS 命中）（如腹腔疾病、溃疡性结肠炎和克罗恩病）相关的常见遗传变异的调控元件来评估细胞类型特异性富集。这种分析可以指定这些 GWAS 命中可能起作用的特定细胞类型，以及可能驱动疾病病因的细胞类型。我们发现 T 细胞在自身免疫性疾病、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩病中最为丰富。我们还发现 BMI 的遗传力在肠内分泌细胞中富集，这表明 BMI 的变异可能部分是由肠道肠内分泌细胞功能区域的遗传变异驱动的。我们注意到高血压与内皮细胞有关，这可能代表内皮细胞的更普遍效应；然而，探索高血压患者是否也有肠道问题会很有趣。无论如何，总的来说，我们可以将特定疾病的遗传性分配给特定的肠道细胞类型。

研究有几个局限性。 首先，对于每位患者，我们通常分析来自每个肠道区域的单个样本。 由于 CODEX 和单细胞数据在很大程度上是一致的，并且受试者之间的差异小于区域之间的差异，因此这些模式很可能代表了这些区域。 同样重要的是要注意，所分析的四名成年人中有三名年龄较大，三名是男性。 跨越广泛年龄和种族的模式仍有待阐明。 我们也没有能力确定性别差异，鉴于男性和女性的疾病风险差异，这可能很重要。 未来可以通过采集更多样本和数据来解决这些限制。

总之，我们展示了人类肠道的详细地图，特别是健康小肠和结肠的第一个多路复用成像参考。 除了生物学见解，这还可以作为肠道疾病（例如 IBD）以及与其他生物体比较的重要参考。

METHOD

Cell Type Analysis

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Cell Type Annotation using STELLAR

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CODEX Cell Density Analysis

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Neighborhood Identification Analysis

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Neighborhood Conservation Analysis

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Community and Major Community Identification Analysis

Communities were determined similar to how multicellular neighborhoods were determined with some minor differences. Briefly, the cells in the neighborhood tissue maps were taken with a larger window size of 100 nearest neighbors. These windows were taken across the entirety of the tissue and the vectors then clustered with k-means clustering and overclustering with 20 total clusters. These clusters were mapped back to the tissue and evaluated for neighborhood composition and enrichment to determine overall community type. Communities were categorized into one of four major communities: epithelial, immune, stroma, or smooth muscle.

Hierarchical Intestine Structural Graphs

Each hierarchical level was connected to the next by either what it contributed to the largest in
the next level, or what made up at least 15% of this next hierarchy. The percentage of each feature in the level was represented by size of the shape. The shape and color combination correspond to the level and feature respectively. The size of the connecting line represents the amount a feature contributes to the next feature.

Spatial Context Maps

Spatial context maps were created as previously described34. Briefly, first only cells which made up either epithelial or immune major cell types were selected for further analysis. Then, windows were taken again with the neighborhood types captured from the 100 nearest neighbors. Individual square combinations were selected by what combination of neighborhoods were needed to make up at least 85% of the total composition of the windows. Combinations were then counted and represented in size by the size of the black circle underneath the square neighborhood combination.

Colocalization Analyses

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Ligand and Receptor Analyse

The FANTOM5 database and 12 more literature-supported experimentally-validated ligand and
receptor pairs were used to obtain the final list of validated ligand receptor pairs (Yu et al., 2021). Non-parametric Wilcoxon rank-sum test was used to identify differentially expressed ligands and receptors in the small bowel versus the colon (adjusted p-value cutoff = 0.05).

Single-nuclei Analytical Methods: Quality control, dimensionality reduction, and clustering of snATAC data

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Single-nuclei Analytical Methods: Integration of snRNA and snATAC data and nomination of regulatory TFs

The snRNA and snATAC datasets from the four primary regions of the intestine (duodenum, jejunum, ileum, and colon) were integrated separately using the ArchR function addGeneIntegrationMatrix with reducedDims = "Harmony" and useMatrix = "GeneScoreMatrix". We then identified TF regulators following the ArchR manual for identifying TF regulators for each region, with a correlation cutoff of 0.6.

生活很好，有你更好