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今天我们继续分享单细胞空间联合分析的内容，分享的文章在Spatial transcriptomics of dorsal root ganglia identifies molecular signatures of human nociceptors，2022年2月发表于Science Translational Medicine，IF 18分，值得学习。
Abstract
伤害感受器是专门的感觉神经元，可检测破坏性或潜在破坏性刺激，存在于背根神经节 (DRG) 和三叉神经节中。这些神经元对于最终产生疼痛感知的神经元信号的产生至关重要。伤害感受器也是治疗急性和慢性疼痛的主要目标。小鼠伤害感受器上的单细胞转录组学改变了我们对疼痛机制的理解。y研究试图为人类伤害感受器生成等效信息，目的是识别伤害感受器的转录组特征，识别物种差异和潜在的药物靶点(药物靶点，嗯，网临床方向靠拢)。使用空间转录组学对来自八个器官供体的单个 DRG 神经元的转录组进行分子表征。鉴定了 12 个人类感觉神经metacluster，其中 5 个是 C 伤害感受器，以及 1 C 低阈值机械感受器 (LTMR)、1 个 Aβ 伤害感受器、2 Aδ、2 个 Aβ 和 1 个本体感受器亚型。通过关注离子通道、G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和其他药理学靶点的表达谱，提供了人类 DRG 中潜在药物靶点的丰富图谱，并与小鼠感觉神经元转录组进行了直接比较。还将人类 DRG 神经元亚型与非人类灵长类动物进行了比较，显示出许多细胞类型中基因表达的保守模式，但特定伤害感受器亚群之间存在差异。最后，确定了人类 DRG 亚群转录组的性别差异，包括女性瘙痒原受体丰富的伤害感受器中降钙素相关多肽 α (CALCA) 表达的显著增加。这种对人类伤害感受器的全面空间表征可能会为开发更好的急性和慢性疼痛疾病治疗方法打开大门。
INTRODUCTION
疼痛是一个重大的医学问题，几千年来一直使用可以追溯到天然产物的药物治疗。尽管最近批准了一些基于机制的新疗法来治疗疼痛，但这些疗法是基于临床研究中的生化观察而开发的，例如与偏头痛相关的降钙素基因相关肽 (CGRP)。将主要在啮齿动物中完成的外周疼痛机制的临床前工作转化为有效的疼痛治疗方法一直令人不满意。这种未能转化的一个潜在解释是，小鼠和人类之间存在伤害感受器分子表型的重要物种差异，这一观点得到了bulk RNA 测序 (RNA-seq) 实验和其他证据的部分支持。伤害感受器是疼痛通路中的第一个神经元，并表达多种受体，使它们能够对来自环境、组织中的局部细胞以及可能参与炎症或其他过程的浸润免疫细胞的刺激作出反应。这些神经元在急性和慢性疼痛状态下都增加了它们的兴奋性，并且其兴奋性表型的变化，例如自发活动的产生，与神经性疼痛等慢性疼痛状态直接相关。因此，伤害感受器是急性和慢性疼痛药物的关键靶细胞。在这里描述的工作中，创建了背根神经节 (DRG) 中人类感觉神经元的高分辨率地图，包括伤害感受器，目的是加速发现和/或验证可以操纵的高质量药物靶点以改善疼痛治疗。
DRG 神经元的单细胞测序描绘了小鼠体感神经元亚型的分子结构，阐明了它们的发育转录路径，并描述了这些神经元如何改变表型以响应损伤。然而，由于缺乏人类感觉神经元的全面转录组图谱，尚不清楚如何将这些信息应用于人类。大多数当代单细胞分析研究都使用核 RNA-seq，因为该技术具有可扩展性、完全商业化且广泛可用。然而，人类 DRG 神经元是体内最大的神经元之一（直径 20 至 100 um），并且具有较大的细胞核，这给许多测序平台带来了挑战。感觉神经元也是具有大细胞质体积的有丝分裂后细胞，其中含有高浓度的核外 RNA。将空间分辨率与准确采样细胞质 RNA 的能力相结合的测序技术可能会更清晰地显示完整的神经元转录组，这在寻找可能具有低表达的药物靶标时很重要。为了克服这些技术挑战并填补关于人类感觉神经元转录组的知识空白，我们对从器官捐赠者获得的人类腰椎 DRG 进行了空间测序实验（10x Genomics Visium 技术，使用 55-um 条形码点）。确定了一种本体感受器、两种 Aβ 低阈值机械感受器 (LTMR)、一种 Aβ 伤害感受器、一种 Aδ-LTMR、一种 Aδ 高阈值机械感受器 (HTMR)、一种 C-LTMR 和五种 C-伤害感受器亚型。将我们的发现与小鼠和非人类灵长类动物数据集进行了比较，不仅发现了许多相似之处，而且发现了重要差异，其中许多对疼痛目标识别具有重要意义。由于疼痛机制的性别差异越来越被认可，我们对相同数量的男性和女性样本进行了研究。预计分析数据将促进我们对人类分子疼痛机制的理解，并为疼痛和瘙痒治疗的发展开辟一条新的道路。
RESULTS
Spatial transcriptomics generates near single-neuron resolution
使用 10x Genomics Visium 空间基因表达平台为单个神经元生成了全细胞转录组。该技术使用印在 Visium 载玻片捕获区域上的 55-um 条形码点。在交叉钳夹后 4 小时内从神经死亡器官供体收集的human DRGs 被切片到 Visium 载玻片的捕获区域，染色和成像。组织透化后，每个切片的 mRNA 与带条形码的引物结合，随后进行文库制备和 RNA-seq 处理。我们平均获得了约 52 M 的reads，每个切片平均检测到约 24,000 个基因，从 16 个组织切片中总共检测到约 830 M 的reads。由于每个部分都经过染色和成像，因此可以使用 Loupe Browser (10x Genomics) 在每个 DRG 部分中可视化带条形码的 mRNA 和相应基因的位置。此外，可以根据它们在组织上的位置来选择带条形码的spot。为了产生接近单神经元的分辨率，选择了在所有部分中与单个神经元重叠的所有条形码，并对其进行处理以进行下游分析。从每个供体的两个组织切片（共 16 个切片）中，确定了 4356 个与单个神经元重叠的条形码（神经元条形码，也包含来自其他周围细胞的一些信号）和 12118 个直接围绕神经元的条形码（周围的条形码）。其余 20,725 个条形码点被归类为其他条形码。与多个神经元重叠的条形码被排除在外。我们优化了组织通透性以增强神经元 RNA 在载玻片上的洗脱，develop neuronally enriched libraries。我们在神经元条形码中检测到更多数量的 RNA 分子和更多数量的独特基因。此外，神经元条形码具有与周围和其他条形码不同的基因表达谱。
分析中，去除了具有低读数和低神经元标记 SNAP25 计数的神经元条形码。 共有 3952 个神经元条形码按供体 ID 分组，并使用 Seurat 的anchor集成工作流程进行聚类，然后进行基于图形的聚类。 最初，Seurat 生成了 16 个cluster。 重点介绍了文献中在这些clusters中丰富的几种已知神经元标记，以根据其特定的基因富集来表征人类 DRG 神经元的这些子集。 最终选择了八个clusters进行合并。 这些中的每一个都是具有高度重叠基因表达的相邻cluster，其中两个clusters合并为一个。 最终得到了 12 个人类 DRG 神经元的最终clusters。
Defining the transcriptomes of human sensory neuron subtypes
DRG 神经元来源于神经嵴细胞，负责将所有躯体感觉（触觉、本体感觉、伤害感受和温度）从身体传递到脊髓和脑干。根据细胞体的直径和传导速度，这些神经元被分为两大类——A 纤维和 C 纤维。有髓 Aβ 纤维神经元大多是直径较大的细胞，它们通过负责检测无害刺激（尤其是轻触）的末端器官支配皮肤。本体感受器支配肌肉和其他结构，并负责传达有关我们四肢在太空中位置的信号。无髓鞘、小直径 C 纤维神经元对于检测大多数有害刺激至关重要。 Aβ 神经元不仅有轻度髓鞘，而且比 C 纤维直径更大，而且对有害范围内的刺激也有反应。这些类别的感觉神经元在发育和成年期间差异表达特定的神经营养受体。
在 A 纤维组中，确定了人类 DRG 中的六种亚型。The first cluster was classified as proprioceptors (cluster 1) based on the expression of parvalbumin (PVALB), neurotrophic receptor tyrosine kinase 3 (NTRK3), and acid-sensing ion channel subunit 1 (ASIC1) and reduction in neurotrophic receptor tyrosine kinase 2 (NTRK2) . 该cluster还富含钾电压门控通道调节剂亚家族 S 成员 1 (KCNS1) 和 Runt 相关转录因子 (RUNX) 家族转录因子 3 (RUNX3) 的丰富表达，在脊椎动物中发挥进化保守作用抑制 A 纤维本体感受器中的 NTRK2。 Aβ 缓慢适应 (SA) LTMR（cluster 2）innervate hairy and glabrous skin并终止于 Merkel cells 细胞。这些神经元富含 NTRK3 和 PVALB，并显示出较低的 NTRK2 表达，这种表达模式与小鼠中的 Aβ SA LTMRs 一致。这些神经元还富含受体活性修饰蛋白 1 (RAMP1) 表达，这是 CGRP 受体的受体成分。 The end organs of Aβ rapidly adapting (RA) LTMRs are Meissner and Pacinian corpuscles in glabrous skin and lanceolate endings in hairy skin。 Aβ RA LTMR subgroup（cluster 3 ）同样通过 NTRK3 的表达和 NTRK2 的低表达来确定。 A-LTMRs 也称为 D 头发传入，在毛囊中以纵向披针形末端终止。 Aδ-LTMRs（cluster 4）的特点是 NTRK2 的高表达。缺乏这种 Ntrk2 阳性神经元subcluster的小鼠对触摸不太敏感，并且在受伤后对机械刺激无反应。这表明 Aδ 纤维可能参与了机械性异常性疼痛的发展。 Aδ 纤维以前在人类皮肤神经中的特征与其他物种的“下毛”Aδ 神经元相似。一组 A 纤维神经元表达 NTRK3 和钠电压门控通道 α 亚基 10 (SCN10A)，这是一种富含伤害感受神经元的电压门控钠通道 (VGNaC)。因此，将这个cluster确定为推定的 Aβ 伤害感受器（cluster 5）。 Aβ-纤维对有害刺激有反应，在包括猴子在内的其他物种中也有报道。最近的一项研究表明，人类也有具有伤害感受特性的 Aβ 纤维伤害感受器。最后的 A 纤维clusters（cluster 7 ）具有 NTRK1、Copine 6 (CPNE6) 和 SCN10A 的高表达，这与小鼠和猕猴中的 HTMR 一致。该cluster还表达降钙素相关多肽 α (CALCA) 和溶血磷脂酸受体 3 (LPAR3)。
还确定了五种 C 纤维伤害感受器亚型和一个putative C-LTMR cluster。瞬时受体电位阳离子通道亚家族 M 成员 8 (TRPM8)，一种已知的薄荷醇和冷敏感通道，标记为冷伤害感受器（cluster 6 ）。该cluster表达 SCN10A 但几乎没有瞬时受体电位阳离子通道亚家族 V 成员 1 (TRPV1)，这是与其他人类伤害感受器cluster相比的独特特征。脑啡肽原 (PENK) 是一种内源性阿片类药物和几种脑啡肽的前体，在另一个 C 伤害感受器cluster（cluster 8）中富集。该cluster还独特地表达肽递质基因尿皮质素 (UCN)，并富含前列腺素 E2 (PGE2) 受体 PTGER3，编码前列腺素 E 受体 3 (EP3)，该受体在 PGE2 受体中不同，在激动剂结合后产生镇痛作用。另一组 C 纤维通过瞬时受体电位阳离子通道亚科 A 成员 1 TRPA1 表达（cluster 9）来区分。该cluster还显示出速激肽前体 1 (TAC1)（编码 P 物质）和 CALCA 的非常高的表达，尽管这些神经肽在所有伤害感受器cluster中广泛表达。神经肽表达的这种差异是人类和啮齿动物感觉神经元之间的重要区别，可能表明人类中不存在感觉神经元的肽能和非肽能subcluster。最近的组织学工作进一步支持了这一观点，表明肽能标记物 CGRP（基因：CALCA）和非肽能标记物 P2X 嘌呤受体 3（P2X3R；基因：P2RX3）在人类 DRG 神经元的 mRNA 和蛋白质水平上高度共表达。这些神经元还共同表达伤害感受器标记钠通道 Nav1.8（基因：SCN10A）。 CGRP 和 P2X3R 传入背角在整个 I 层和 II 层中都存在，支持它们在人类伤害感受器中的高共表达。
胆碱能受体烟碱 α 3 亚基 (CHRNA3) 的特异性表达确定了一组putative “沉默”伤害感受器（cluster 10）。Silent nociceptors 对应于支配关节、内脏和皮肤的 C 纤维 subset，通常被称为机械不敏感 C 纤维。它们在正常情况下对有害的机械刺激无反应，但在炎症刺激后变得敏感并变得机械敏感，并且可能在某些疼痛疾病中起关键作用。Silent nociceptors cluster表达大量离子通道，包括血清素受体 5-羟色胺受体 3A (HTR3A)；嘌呤能受体 P2X 3、4、6 和 7 (P2RX3、P2RX4、P2RX6 和 P2RX7)；质子受体酸感应离子通道亚基 3 (ASIC3)；和谷氨酸受体，例如谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基 2 至 5（GRIK2、GRIK3、GRIK4 和 GRIK5）、谷氨酸离子型受体 δ 型亚基 1 (GRID1)、谷氨酸离子型受体 N-甲基-d-天冬氨酸 (NMDA) 型亚基 1 (GRIN1) 和谷氨酸离子型受体 β-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸型亚基 3 和 4 (GRIA3 和 GRIA4)，这可能是这部分神经元对炎症介质敏感的基础。这些神经元还表达 H1 组胺受体基因，即组胺受体 H1 (HRH1)，已知该基因可使这些神经元对机械刺激敏感，并且也是组胺诱导的人类瘙痒的可能途径。因此，这个 C 纤维子集可能也参与了来自外围的瘙痒信号的产生。根据利钠肽 B (NPPB)、GDNF 家族受体 α2 (GFRA2) 和白细胞介素 31 受体 A (IL31RA) 的表达，对一个单独的富含瘙痒原受体的cluster（cluster 11）进行分类，尽管后两者在其他人群中也发现了基因。数据还显示钠电压门控通道 α 亚基 11 (SCN11A) 在该亚群中的表达非常高。 Nav1.9 (SCN11A) 功能突变增益可导致先天性对疼痛不敏感或部分痛觉丧失。对小鼠的研究报告称，这种突变会导致瘙痒表型。携带 Nav1.9 突变的人报告有严重的瘙痒。与 SCN11A 在瘙痒伤害感受器中富集相关的机制可以解释这种表型。最终的 C 纤维clusters富含 GFRA2，GFRA2 是小鼠中 C-LTMR 的特征标记，被归类为推定的 C-LTMR（cluster 12）。该cluster在基因表达方面与富含瘙痒原受体的群体具有高度相似性，但 NPPB 的表达较低，NPPB 是小鼠瘙痒伤害感受器的标志物。
Spatial visualization of neuronal subtypes
腰椎 DRG 神经元亚型在任何分析的组织切片中均未显示出任何清晰的空间组织。 然而，确实使用 DRG 部分中条形码位置的可视化来测量与 12 个clusters中的每一个相关的神经元直径。 这一独立测量验证了 Aβ cluster对应于 DRG 中直径最大的神经元，而 C 伤害感受器cluster是最小的。 A∂ cluster的大小介于 Aβ 和 C 纤维神经元之间，与所有其他已评估的物种的细胞大小分布一致。
Validation of spatial transcriptome-defined subtypes with RNAscope
空间转录组学方法提供了对人类 DRG 中存在的神经元类型的详细洞察，但存在局限性，例如任何给定条形码都缺乏纯单个神经元转录组。之前已经证明，RNAscope 原位杂交技术可以高度灵敏地检测人类 DRG 中的神经元 mRNA。作为验证工具，对人类 DRG 组织切片进行了 RNAscope 实验，检测了几种在特定神经元cluster中显示出高丰度的 mRNA：PR/SET 域 12 (PRDM12)、NPPB、生长抑素 (SST)、NTRK1-3、PVALB、LPAR3、 PENK、TRPM8、GFRA2、MAS 相关 GPR 家族成员 X1 (MRGPRX1) 和酪氨酸羟化酶 (TH)。评估了它们与富含伤害感受器的基因 SCN10A、TRPV1 和 CALCA 或其他clusters特异性标记的共表达。伤害感受器群体（SCN10A+、TRPV1+ 或 CALCA+）占所有人类感觉神经元的约 60% 至 70%，并且直径很小（平均 = 54 um）。PRDM12，一种对人类疼痛感知至关重要的基因，在也共表达 CALCA 的约 74% 的背根神经节神经元中表达。在 Visium 数据的所有神经元cluster和周围/其他条形码中检测到 CALCA mRNA，可能是因为 CALCA mRNA 定位于轴突，解释了其广泛检测。较小的伤害感受器细分，例如假定的沉默和瘙痒原受体丰富的伤害感受器群体（NPPB+ 或 SST+），占也共表达 SCN10A 的群体的约 30%。 NTRK1 在伤害感受器cluster中最为丰富，在 68% 的神经元群体中发现并与 SCN10A 共定位。 NTRK2 在 A LTMR cluster 中富集，这是一个耗尽 SCN10A 的cluster，在中等大小的神经元中检测到，与 SCN10A 几乎没有共表达。本体感受器 Aβ-LTMR 和 Aβ 伤害感受器标记 NTRK3 存在于较大尺寸的神经元中，与 SCN10A 的共表达略高于 NTRK2，这很可能是由于其存在于 SCN10A+ Aβ 伤害感受器cluster中。在 Visium 数据集中，LPAR3 在 A HTMR 和 Aβ 伤害感受器cluster中富集，但在其他伤害感受器clusters中也低表达，所有这些clusters都表达 TRPV1。同样，LPAR3 在 80% 的感觉神经元中表达，其中大部分是 TRPV1 阳性的。 PVALB 在本体感受器和 Aβ SA LTMR clusters中高度富集，在约 45% 的感觉神经元中发现，其中一半是 TRPV1 阴性的。在约 50% 的感觉神经元中发现了冷伤害感受器cluster标记 TRPM8，而在约 35% 的感觉神经元中发现了 whereas PENK, which was enriched in a different cluster。与 Visium 类似，这两个基因使用 RNAscope 确实显示出一些重叠（21.2%），但也在不同的population中检测到
在putative C-LTMR cluster中表达的 GFRA2 在约 33% 的小型人类感觉神经元和高度共表达的 MRGPRX1 中发现。 MRGPRX1 仅在少数条码中检测到，均在 C-LTMR cluster中； 然而，使用 RNAscope 检测到更多的 MRGPRX1+ 神经元，其中许多对 GFRA2 呈阳性。 TH 是 C-LTMR 的小鼠标记，使用 Visium 和 RNAscope 在human DRG 中几乎没有表达。 为了进一步评估该cluster，评估了 GFRA2 与 NPPB 组合的表达，因为我们将该cluster分类为潜在的 C-LTMR population，因为它的 GFRA2 表达和 NPPB 的消耗。 观察到对 GFRA2 和 NPPB 呈阳性反应的神经元 (~27.3%) 和少量表达 GFRA2 的神经元对 NPPB 呈阴性反应 (7.4%)。 这个 GFRA2 阳性、NPPB 阴性的population可能代表了 C-LTMR cluster 12 。
之前报道过 TRPV1 mRNA 在人类伤害感受器中的表达比在小鼠中更广泛，并且在所有伤害感受器cluster中都检测到了 TRPV1，除了轻微表达的cold nociceptors。使用 SCN10A 作为伤害感受器标记，再次观察到在大多数伤害感受器中发现了 TRPV1。接下来确定这些神经元是否对 TRPV1 配体辣椒素有功能反应。辣椒素的应用使所有小型、分离的人类 DRG 神经元去极化，并导致 75% 的动作电位放电。得出结论，RNAscope、空间测序和功能分析支持 TRPV1 在人类伤害感受器中的广泛表达。作为最终验证，之前发表的 RNAscope 研究结果证实了 Visium 测序提出的神经元亚群。例如，之前提出 KCNS1 作为人类 Aβ 神经元的标记，因为它在 CALCA 和 P2RX3 呈阴性的大型神经元中表达。使用空间转录组学方法，KCNS1 was also enriched in Aβ clusters。
Sex differences in human sensory neurons
雄性和雌性感觉神经元之间的分子差异已在啮齿动物的特定群体细胞测序实验中得到报道，并从人类 DRG 的bulk RNA-seq 中推断出来，但我们对人类 DRG 中神经元基因表达的性别差异的了解有限。根据我们的结果，很明显，男性和女性具有相同的 DRG 神经元亚型，因为来自两性的神经元条形码在所有cluster中都清楚地显现。然后，在整个神经元细胞和每个特定cluster内寻找性别差异。使用空间测序方法，神经元条形码包括来自周围细胞的 mRNA。为了克服对其他细胞类型贡献的一般性别差异的检测，对周围的条形码（整体周围的条形码和特定于每个神经元cluster）进行了统计测试。如果倍数变化 (FC) ≥ 1.33 且调整后的 P < 0.05，则认为基因存在差异表达 (DE)。如果基因在各自的周围条形码中不是 DE，认为基因在神经元中是 DE。与在神经元population中性别差异很小的小鼠中的发现相似，在按性别汇集的神经元条形码中仅鉴定了 44 个具有性别差异表达的基因。然而，这种方法将转录组不同神经元的表达数据汇集在一起，创造出主要是不同细胞表型产物的变异。为了克服这个问题，研究了每个神经元亚型中基因表达的潜在性别差异。在这里，发现了更多富含神经元的 DE 基因。富含瘙痒原受体的population具有最多的 DE 基因，这表明男性和女性之间瘙痒机制存在潜在的分子差异。使用 GO 富集分析资源 PANTHER 对所有神经元亚群中的 DE 基因进行了基因集富集分析。没有在本体感受器、A∂ LTMR、冷伤害感受器、A∂ HTMR、PENK+ 伤害感受器、TRPA1+ 伤害感受器、putative 沉默伤害感受器或 C-LTMR 中发现任何 GO terms。我们确定了 GO terms表示富含瘙痒原受体的亚型，84 个用于 Aβ SA LTMR，6 个用于 Aβ RA LTMR。对人类伤害感受器的潜在性别差异特别感兴趣，因此专注于富含瘙痒原受体的cluster。在该cluster中的一个主要发现是 CALCA 的更高表达，它编码 CGRP 蛋白，在富含女性瘙痒原受体的神经元中发现。这一发现在检查男性和女性器官供体的 NPPB 阳性神经元中 CALCA 表达的 RNAscope 实验中得到验证。
Similarities and differences between human and mouse DRG neurons with a focus on pharmacological targets
接下来，检查了基因家族中单个基因的表达，例如离子通道、G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和酪氨酸受体激酶，它们参与伤害感受器传递伤害感受信号，被认为是现有或潜在的药物。 对来自人类 DRG 的空间转录组数据集和来自 mousebrain.org 的 DRG 的小鼠单神经元数据进行了比较。 大多数临床前研究都是在啮齿动物（特别是小鼠）中进行的，因此下面的比较表达图可用于直接评估小鼠和人类之间感觉神经元基因表达谱的异同。
VGNaCs 是神经元携带动作电位能力的基础，感觉神经元表达这些基因的独特子集。我们观察到 VGNaC 基因在人和小鼠中具有非常相似的表达模式，这表明编码通道成孔单元的 α 亚基的表达是保守的。该家族中的一个例外是钠电压门控通道 β 亚基 4 (SCN4B) 基因，它编码 VGNaC 的 β4 亚基。这个 β 亚基对于作为兴奋性关键贡献者的复苏电流至关重要。在小鼠中，Scn4b 主要存在于 A 纤维神经元中，与之前的研究一致，但在人类中，SCN4B mRNA 分布在所有感觉神经元类型中。因为 β 4 亚基通过 Nav1.8 通道调节再生电流，并且这两个基因在人类伤害感受器中的共表达程度更高，这可能有助于增强这些细胞中的再生 Nav1.8 电流，这一假设可以在未来的实验中进行检验。
GPCR 是哺乳动物基因组中最大的受体家族，在从炎症检测到细胞粘附的伤害感受器中具有多种作用。这些受体也是治疗发展的重要目标。比较了人类 DRG 中表达最高的 50 个 GPCR 与其在小鼠中的同源物的表达和分布。尽管一些 GPCR 显示出一致的表达模式，但许多 GPCR 存在分歧，表明该受体家族在物种间的表达存在重要差异。两个显著差异是 PTGER3 和 LPAR3 基因。 PTGER3 在人类的 PENK+ 伤害感受器群体中富集，并且也由其他几种伤害感受器亚型表达，而它仅限于小鼠的非肽能神经元子集。鉴于这种前列腺素受体作为镇痛靶点的潜力，这对于 EP3 激动剂的治疗目的可能很重要。 LPAR3 是溶血磷脂酸的受体，与神经性疼痛有关。这种 GPCR 在人类的伤害感受器亚型中广泛表达，但再次仅限于小鼠的非肽能伤害感受器。代谢型谷氨酸受体家族 (GRM) 的受体在物种间也表现出不同的表达，这与之前的观察结果一致，即在人类 DRG 中未检测到 I 组 GRM 家族基因。一些 GPCR 确实表现出强烈的表达保守性，例如，γ-氨基丁酸 (GABA) B 型受体亚基 2 (GABBR2)，编码 GABAB 受体复合物的一个亚基，这可能是表达最高的 Gαi 偶联受体在人和小鼠的感觉神经元中。
白细胞介素 (ILs) 及其受体在神经元亚群中的表达特征可以揭示它们的配体如何与不同物种的不同感觉神经元群相互作用。 例如，IL31RA 在人类 DRG 神经元中的表达比在该基因仅限于瘙痒伤害感受器的小鼠中更广泛地表达，如先前使用原位杂交所示。 抗炎 IL 受体、IL-4 受体 (IL4R)、IL-10 受体亚基 α (IL10RA) 和 IL-13 受体亚基 α1 (IL13RA1) 在人类感觉神经元亚型中的表达比在小鼠中更广泛，其中 Il4r 是 没有检测到。 其他基因如 IL-6 细胞因子家族信号转导 (IL6ST) 在人和小鼠中表现出保守表达。
检查了人类和小鼠神经元亚型中其他基因家族的表达，包括：ASICs、anoctamins、水通道蛋白、钙通道、氯离子通道、胆碱能受体、离子型 GABA 受体、间隙连接/连接蛋白、离子型谷氨酸受体、甘氨酸受体、神经肽基因、 钾通道、离子型嘌呤受体、瞬时受体电位通道和参与神经元分化的转录因子。 我们还研究了编码蛋白质的基因表达，这些蛋白质是未充分研究的可成药基因组的一部分。 我们在人类 DRG 神经元亚型中检测到 56 个未充分研究的 GPCR、49 个未充分研究的离子通道和 133 种激酶。 最后，创建了具有最低归一化熵的基因的表达图，代表在神经元亚型中表达差异最大的基因.
Comparison of human and nonhuman primate sensory neuron subtypes
接下来，我们利用最近发表的来自非人类灵长类 DRG 的单细胞数据集来比较人类和猕猴之间的神经元亚型。
DISCUSSION
工作表明，空间转录组学可用于产生接近单神经元的分辨率，以定义人类 DRG 中神经元亚型的分子谱。 我们的研究结果不仅证明了小鼠和人类之间的许多相似之处，而且还表明了它们之间的实质性差异，其中大多数单伤害感受器转录组工作已经完成。 其中一些差异可以通过与测序方法相关的技术问题来解释； 然而，我们展示了猕猴和人类之间更一致的相似性，其中还应用了不同的测序技术，这使得这种可能性不太可能。
我们实验的一个重要结果是现在能够以单神经元分辨率直接评估跨物种的目标表达。 我们列出了小鼠和人类 DRGs 中大多数药理学相关靶点的这些表达谱。 This expression map can allow investigators to initiate DRG-focused target identification efforts with human neuronal transcriptome insight and then make data-driven choices about model species and testing paradigms that best fit the chosen development pipeline.
小鼠和人类感觉神经元之间进化差异最大的一个领域是神经肽、TRPV1 和 NTRK1 表达。 这与之前的原位杂交工作一致。 在小鼠和大鼠中，这些基因在发育早期受到所有伤害感受器的表达调节，然后在出生后靶神经支配后在特定人群中沉默。 与啮齿动物相比，大多数人类伤害感受器共享这些基因的表达，这表明在其他物种（尤其是小鼠）中发现的许多肽能和非肽能伤害感受器的标记混合在一起。 这表明肽能和非肽能命名法不太可能用于描述人类伤害感受器。 Our findings suggest that development programs that silence TPRV1 and NTRK1 expression in subgroups of nociceptive sensory neurons are not engaged in humans.
我们发现，在富含瘙痒原受体的人群中，受体和神经肽表达存在重要差异，许多已在小鼠中鉴定的标志物更广泛地表达，特别是在沉默的伤害感受器和推定的 C-LTMR 亚型中。这与先前的研究一致，这些研究显示了瘙痒原受体基因（如 IL-31 受体）的表达存在物种差异。这也与最近一项比较猕猴和人类 DRG 表达瘙痒原受体 [MAS 相关 GPR 家族成员 D (MRGRPD) 和 MRGPRX1 与 TRPV1 共表达] 的研究一致。这与小鼠实验形成对比，在小鼠实验中，Mrgprd 由没有 Trpv1 的神经元子集表达。 Klein 及其同事还证明，与 MRGPRD 或 MRGPRX1 激动剂相比，组胺在人类志愿者中产生更大面积的耀斑和风团。这一发现可以通过在人类 DRG 中表达 HRH1（H1 组胺受体）的神经元群体的扩张来解释。我们使用 Visium 和 RNAscope 都没有发现人类 DRG 中大多数已知的 C-LTMR 标记的表达，例如 TH。这还包括缺乏最近在猕猴核测序研究中发现的标记，这使得在我们的研究中难以识别这一population。例外的是 GFRA2+ 表达，它标记了跨物种的 C-LTMR，从而能够推定识别人类 DRG 中的 C-LTMR。该亚群通过 RNAscope (GFRA2+/NPPB-) 进行了验证。
Our spatial transcriptomic characterization of human DRG neuronal subtypes should facilitate discoveries in the pain and sensory neuroscience field. One advance is the identification of sets of markers that can be used to molecularly phenotype subtypes of sensory neurons that can be sampled through skin biopsies and other methods from neuropathy patients. Although there are clear indications of pathology in sensory neurons indicated from clinical skin biopsy studies, these are almost always grouped into small and large fiber neuropathies, but further distinctions are not made. Our work enables greater mechanistic insight from routine clinical tests. The finding that neuronal transcriptomes in the DRG are stable unless frank axonal injury has occurred suggests that our dataset can be used for this purpose almost immediately. Our dataset can also be used to mine for pharmacological targets that can be used to specifically manipulate the excitability of different subsets of nociceptors. This offers the possibility for the development of pain targets that are identified based entirely on human transcriptomic data. Our dataset contains both male and female samples. We highlight sex differences (for example, greater CGRP expression in the pruritogen receptor–enriched population in females) that may be important considerations for therapeutic development. Last, this dataset can be a foundation to more thoroughly vet targets that have been found in studies of peripheral nerves in animal pain models. Our findings might make it possible for conservation of gene expression in human nociceptors to be a first step in derisking pain targets for future drug development.
生活很好，有你更好
