通过前期的分析，我们确定了感兴趣的module，但是module中又含有几十甚至上百的基因，下一步需要进一步筛选hub gene。
WGCNA（3）：基因模块与性状关联识别重要基因 - 简书 (jianshu.com)
差异基因，hub 基因以及关键基因的区别，可以去看这篇帖子：
关键基因和hub基因（生物网络角度） - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com)
1. 准备工作
导入前期数据，这里我选择了分步法构建网络的结果，大家可以根据自己的数据选择使用哪种方法构建网络。
# 设置工作目录
> setwd("D:/RNA-seq/WGCNA/mad0.3/cor 0.25")
# 载入WGCNA包
> library('WGCNA')
# 允许R语言以最大线程运行
> options(stringsAsFactors = FALSE)
> allowWGCNAThreads()
Allowing multi-threading with up to 4 threads.
# 载入第一步中的表达量和表型值
> lnames = load(file = "WGCNA0.3-dataInput.RData")
> lnames
# 载入第二步的网络数据
> lnames = load(file = "networkConstruction-stepByStep.RData")
> lnames
2. 筛选hub基因
2.1 筛选key module
- 在上一步基因模块与性状的热图中，可以明显看到和性状相关性最强的基因模块是哪一个，即为key module。
- 当然也可以反向找，感兴趣的基因在哪个module里，这个module就是key module。
由于我没有目的基因，所以这里都将与性状相关性最强的module当做Key module。
参考文章：WGCNA关键模块和hub基因筛选 - 简书 (jianshu.com)
2.2 筛选hub gene
在确定key module后，需要进一步确定hub gene，通常有三种方法。
a. 连接度 connectivity
参考材料：
https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/Tutorials/Simulated-07-Membership.pdf
这里需要计算每个基因的连接度，在网络分析里通常称为degree。
- 整个网络的连接度是kTotal
- 模块连接度是kWithin，
- kOut=kTotal-kWithin
- kDiff=kIn-kOut=2*kIN-kTotal
# 这部分计算量还挺大的，如果基因数目多的话需要在Linux下计算
> ADJ=abs(cor(datExpr,use="p"))^6
> Alldegrees =intramodularConnectivity(ADJ, moduleColors)
> write.csv(Alldegrees, file = "intramodularConnectivity.csv")
绘制GS和连接度的相关性散点图：
## 这部分在专题（3）中计算过一次，因为没有保存，所以这里又重新计算
> nSamples = nrow(datExpr)
# 指定datTrait中感兴趣的一个性状，这里选择weight_g
> weight = as.data.frame(datTraits$weight_g)
> names(weight) = "weight"
# 各基因模块的名字（颜色）
> modNames = substring(names(MEs), 3)
# 计算MM的P值
> geneModuleMembership = as.data.frame(cor(datExpr, MEs, use = "p"))
> MMPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneModuleMembership), nSamples))
> names(geneModuleMembership) = paste("MM", modNames, sep="")
> names(MMPvalue) = paste("p.MM", modNames, sep="")
# 计算性状和基因表达量之间的相关性（GS）
> geneTraitSignificance = as.data.frame(cor(datExpr, weight, use = "p"))
> GSPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneTraitSignificance), nSamples))
> names(geneTraitSignificance) = paste("GS.", names(weight), sep="")
> names(GSPvalue) = paste("p.GS.", names(weight), sep="")
下面代码可以实现GS和degree的回归散点图：
> colorlevels=unique(moduleColors)
> pdf("GS vs. degree_weight.pdf",width = 14,height = 8)
# 布局。这个可以根据自己的module数目进行调整。我有20个module，所以这里设置了4行，每行5个图
> par(mfrow=c(4,5))
# 设置图形边界，四个数字分别对应下左上右
> par(mar = c(5,5,3,3))
> for (i in c(1:length(colorlevels)))
{
whichmodule=colorlevels[[i]];
restrict1 = (moduleColors==whichmodule);
verboseScatterplot(Alldegrees$kWithin[restrict1],
geneTraitSignificance[restrict1,1],
col=moduleColors[restrict1],
main=whichmodule,
xlab = "Connectivity", ylab = "Gene Significance", abline = TRUE)
}
> dev.off()
Figure 1: Gene significance (y-axis) vs. intramodular connectivity (x-axis) plotted separately for each module in the
simulated data set. For the green and the brown module we observe that intramodular hub genes tend to have high
gene significance. The opposite is true in the turquoise module.
图中可以看出，weight这个性状中，green和brown两个module中的GS和连接度的相关性最好，这两个module中的hub gene有更高的GS。
b. KME （官方）
这个方法是WGCNA官方说明书推荐的，通过计算KME值（module eigengene-based connectivity）来衡量基因和模块的关系，通常选择|kME| >=阈值（0.8）来筛选出hub gene。
- kME = cor(x, ME)，x是基因表达量
Hub genes are those that show most connections in the network as indicated by their high KME (eigengene connectivity) value.
# 基于准备工作，进行下列计算
# 计算KME值
> datKME=signedKME(datExpr, MEs, outputColumnName="kME_MM.")
> write.csv(datKME, "kME_MM.csv")
# 提取感兴趣的module，这里以lightyellow为例
> FilterGenes = abs(datKME$kME_MM.lightyellow) > 0.8
# 返回结果
> table(FilterGenes)
FilterGenes
FALSE TRUE
41584 41
# 共有41个gene，输出结果
> hubgene_lightyellow <- dimnames(data.frame(datExpr))[[2]][FilterGenes]
> write.csv(hubgene_lightyellow, "hubgene_KME_lightyellow.csv")
这里的41个gene里发现有不是这个module里的基因，修改如下：
> datKME=signedKME(datExpr, MEs, outputColumnName="kME_MM.")
> module = "lightyellow"
> column = match(module, modNames)
> moduleGenes = moduleColors==module
> lightyellow_module<-as.data.frame(dimnames(data.frame(datExpr))[[2]][moduleGenes])
> names(lightyellow_module)="genename"
> lightyellow_KME<-as.data.frame(datKME[moduleGenes,column])
> names(lightyellow_KME)="KME"
> rownames(lightyellow_KME)=lightyellow_module$genename
> FilterGenes = abs(lightyellow_KME$KME) > 0.8
> table(FilterGenes)
FilterGenes
FALSE TRUE
638 39
> lightyellow_hub<-subset(lightyellow_KME, abs(lightyellow_KME$KME)>0.8)
> write.csv(lightyellow_hub, "hubgene_KME_lightyellow.csv")
这里就只有39个了，都在module里。
c. MM & GS （常用）
在专题（3）中，我们绘制了MM vs. GS的散点图：
MM vs. GS
hub基因即为图中右上角的基因，生信技能树中有相关的介绍：
WGCNA得到模块之后如何筛选模块里面的hub基因 (qq.com)
即通过MM和GS进行筛选，这里的标准不固定，根据自己的数据进行更改。这里我用的标准是|GS|>0.2,|MM|>0.8。
# 选择lightyellow模块
> hub<- abs(geneModuleMembership$MMlightyellow)>0.8 & abs(geneTraitSignificance)>0.2
> table(hub)
hub
FALSE TRUE
41595 41
> hub<-as.data.frame(dimnames(data.frame(datExpr))[[2]][hub])
> write.csv(hub, "hubgene_GSMM_lightyellow_weight.csv")
这里发现，41个gene中有不属于这个module的基因，评论区的小伙伴们也遇到了这个问题，检查后修改如下：
> module = "lightyellow"
> column = match(module, modNames)
> moduleGenes = moduleColors==module
> lightyellow_module<-as.data.frame(dimnames(data.frame(datExpr))[[2]][moduleGenes])
> names(lightyellow_module)="genename"
> MM<-abs(geneModuleMembership[moduleGenes,column])
> GS<-abs(geneTraitSignificance[moduleGenes, 1])
> lightyellow_MMGS<-as.data.frame(cbind(MM,GS))
> rownames(lightyellow_MMGS)=lightyellow_module$genename
> hub_b<-abs(lightyellow_MMGS$MM)>0.8&abs(lightyellow_MMGS$GS)>0.2
> table(hub_b)
FALSE TRUE
638 39
> lightyellow_hub_b<-subset(lightyellow_MMGS, abs(lightyellow_MMGS$MM)>0.8&abs(lightyellow_MMGS$GS)>0.2)
> write.csv(lightyellow_hub_b, "hubgene_MMGS_lightyellow.csv")
这里和上面一样了，39个gene。
另外在这个地方，我发现|MM|>0.8和上面|KME|>0.8选出来的hub gene是一样的，所以这两个是一个东西吗？有没有了解的大佬能帮我解答一下，不胜感激。（这个问题已经解决，评论区有一个大佬有回答）
d. chooseTopHubInEachModule()
WGCNA中有一个自带函数，chooseTopHubInEachModule()，可以获得每个module中最核心的一个hub gene，注意这个结果每个模块只返回一个hub gene。
> HubGenes <- chooseTopHubInEachModule(datExpr,moduleColors)
> write.csv (HubGenes,file = "TopHubGenes_of_each_module.csv",quote=F)
e. weighted
在将模块信息导出为Cytoscape格式时，计算了每个基因的weight，也可以作为筛选hub gene的标准。
WGCNA（5）：模块导出至其他可视化软件 - 简书 (jianshu.com)
> cyt = exportNetworkToCytoscape(modTOM,edgeFile =
paste("CytoscapeInput-edges-", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""),
nodeFile = paste("CytoscapeInput-nodes-", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""),
weighted = TRUE,
threshold = 0.1,
nodeNames = modProbes, nodeAttr = moduleColors[inModule])
- weighted = TRUE，计算weighted值
- threshold = 0.1，筛选weighted的阈值，对于我的数据，0.1时edge只有27个，调整到0.08，则有218个。
- 也可以直接通过weighted值排序，直接选择最高的一部分基因作为hub，例如nTop = 30。
> nTop = 30
> IMConn = softConnectivity(datExpr[, modProbes])
> top = (rank(-IMConn) <= nTop)
> cyt = exportNetworkToCytoscape(modTOM[top, top],edgeFile =
paste("CytoscapeInput-edges-", paste(module, collapse="-"), "_top30.txt", sep=""),
nodeFile = paste("CytoscapeInput-nodes-", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""),
weighted = TRUE,
nodeNames = modProbes, nodeAttr = moduleColors[inModule])
这篇帖子的初衷，是我发现在找hub基因的时候，大家有各种各样的办法，但是好像没有一个人把所有的方法系统整理出来。我很想把所有的方法都试一遍，然后选择一个适合自己数据的最优解。
但是在整理的时候发现，这里面有很多东西我都不是很理解，包括WGCNA说明书后面模拟数据的一大部分分析，我都没有特别理解，只能把自己大概的理解分享出来，如果有错误的地方，非常希望懂行的老师同学批评指导，也希望有想法的小伙伴可以互相交流。
