重叠配对末端读数由FLASH（v1.2.11）组装[36]。具有97%相似性的序列在USEARCH（v7.0.1090）管道[38]中与UPARSE[37]聚类成操作分类单位（OTU）。SILV A数据库（v132）用于分类学分配[39]。过滤掉分类为线粒体或叶绿体的OTU，并使用QIIME（single_rarefication.py）通过稀释至最小序列深度将丰度标准化。通过QIIME估算α多样性（α多样性），以评估样本中物种的复杂性，包括观测物种，Chao1，Shannon，Simpson，基于丰度的覆盖估计（ACE）和系统发育多样性指数（PD_whole_tree）[40]。使用QIIME和R脚本（v3.3.1），使用Bray-Curtis距离矩阵进行Beta多样性（β多样性）分析。PERMANOV A用于评估使用R包“vegan”中的“adonis”函数的数据集之间的差异[41]。通过使用R软件中的“factoextra”和“ggplot2”包对过滤的OTU表的相对丰度进行主成分分析（PCA）。使用所有样品的Bray-Curtis距离和环境因素的欧几里得距离在R包“vegan”中进行Mantel测试以评估细菌群落和环境因素之间的相关性，并且通过Spearman与9999个排列的相关性进一步测试。然后，使用典型相关分析（CCA）来证明使用R中的“phyloseq”和“microbiome”包的相关性。为了识别响应于生长阶段或田间管理的指示物种，在R中使用“multipatt”。进行“indispecies”包以测试OTU丰度与这些变量之间的相关性。然后，使用R包“edgeR”中的“glmLRT”函数进行似然比检验，以测试OTU对生长阶段或现场管理的敏感性。对于宏基因组数据的功能组成，PICRUSt（v1.1.1）[42]基于Greengenes系统发育[43]进行，功能使用KEGG（京都基因和基因组百科全书）Orthology进行分类[44]。使用R中的“ComplexHeatmap”软件包生成了一个由欧几里得距离聚类的热图，以显示预测的基因功能的强度。
使用R“stats”软件包（v4.0.2）进行统计分析，结果在p<0.05时被认为具有统计学意义。应用带有Dunn多重比较事后检验的Kruskal–Wallis检验来评估组之间α多样性指数的方差。使用STAMP（v2.1.3）通过Welch's t检验评估组间细菌丰度的差异[45]。
图3。典型对应分析（CCA）排序图显示了第一（A）和第二（B）作物季节水稻根细菌群落组成与环境变量之间的相关性。数据点由样本着色。圆形和三角形分别表示来自常规场和有机场的样品。仅显示通过边际测试评估时具有统计学显着性的环境变量。箭头的方向和长度表示与其他变量相比，陡度增加和变量强度。EC：土壤电导率；组织。mat：土壤有机质含量；和pH：土壤pH。
总之，我们在连续两个作物季节的幼苗和分蘖生长阶段研究了常规和有机稻田中的水稻根系内生微生物组。我们的研究表明植物生长阶段，田间管理系统以及这两个因素之间的相互作用对水稻根系内生细菌群落组成的显着影响，但对其α-多样性没有影响。在这些因素中，生长阶段在塑造根微生物组中起着最重要的作用。我们还发现土壤pH和有机质含量影响根微生物组。此外，我们根据植物生长阶段和田间管理系统确定了潜在的指示物种。本研究展示了不同耕作制度下水稻根系微生物组随时间的动态变化，为微生物组管理提供了新的见解。需要进一步的研究来揭示和操纵微生物组的功能，以提高农业系统的可持续性。
