写在前面
早前，我已经通过插件的方式，让所有 TBtools 用户，都能完成 RNAseq 数据分析，从测序原始数据到基因表达量，使用的是一个曲线救国的策略，即直接使用 kallisto，跳过读段回帖，直接进行读段计数。
目前，更为常用的 RNAseq 上游数据分析流程，应该还是读段回帖之后进行读段计数。一般情况下，使用的软件是：star / hisat2。前者对内存要求高，而后者做了专门的层级索引设计，可以在个人电脑甚至是笔记本（比如我的笔记本 8G 内存）上完成绝大多数物种的转录组读段回帖。
于是，前几天对应的插件都开发出来了，即 hisat2-build 和 hisat2-align。走到这里，我们还能更进一步，做更有意义的事情。
早前的Kallisto本身是依赖于基因组基因结构注释的，其准确程度颇受已有注释的影响，而hisat2等基于回帖的，我们可以进一步做注释“自动校正”以及新转录本或基因挖掘。更为全面一些。这些，则往往常用的软件是 Stringtie。
Stringtie目前为止，并没有人编译windows版本（有点像 MCScanX 当初的情况），于是我做了尝试，调整了源码，并编译了（注：苹果用户 Mac 直接有可用程序，不存在这个问题）。折腾折腾，现在我们可以直接在 TBtools 里面进行转录组的有参考组装以及基于读段回帖的表达量估计。
于是，有必要整理一个教程，理清四个插件的使用，步骤如下：
- Hisat2-Build 建立索引
- Hisat2-Align 进行读段回帖
- Stringtie-Assembly 进行转录本组装
- Stringtie-Quantify 进行表达量估计
插件获取
插件直接从 TBtools 插件商店获取。主要到推荐从高速商店获取，参考前述推文《Plugin | 高速版插件商店！我又有一个绝妙的 idea》。
示例数据
Hisat2-Build 建立索引
设置基因组序列文件，用于建立索引
点击Start，并等待即可
可以看到输出目录会新的索引相关文件产生
如此，即完成了索引构建。
Hisat2-Align 进行读段回帖
总的来说，基本没什么特别要注意的，除非数据是链特异的，那么最好设置一下。另外是，是否很关注多匹配的reads，如repeat区域，那么可以考虑提高max hits。
恩，Threads 参数控制的是并行任务数目，而不是stringtie运行时的线程数。简单来说，假设输入的是 6 个样品，Threads设置为 2 ，那么同时会有最多两个样品在进行组装（即并行）。
输出结果会放置在输出目录下，
大体如下，
注意到，本文示例中只设置了一个样品，即reads。如果是多个样品，那么会分别输出4个类似文件。
Stringtie-Assembly 进行转录本组装
可能唯一需要注意的就是....并行任务数，可参考前述推文，其实常常也无需修改，一般按照电脑有多少个线程，保留2个，剩下的都可以用上试试。
示例数据只有一个样品，所以只组装出一个XXXX.assembly.gtf。无论有多少个输入样品，最终每个样品都会被独立组装，最后合并成一个 merged.stringtie.gtf。这个文件，可用于后续任何分析（亦即，完成了转录本组装）。
Stringtie-Quantify 进行表达量估计
Stringtie 除了进行组装，还可以估算转录本以及基因的表达量。
按照要求设置文件即可，可能需要调整的就是read length，如果你想要得到 read counts，用于下一步差异表达分析的话。
运行后，可以看到在输出目录增加了 6 个文件。
具体不详细展开。大伙应该知道是啥。
插件均已上传至高速商店，
感兴趣地同样参考前述推文《Plugin | 高速版插件商店！我又有一个绝妙的 idea》
写在最后
今天是大年初一 ~~~
新年新气象，
祝所有 TBtools 用户朋友，
牛年大吉！
