写在前面
前述，我已经写了两个 TBtools 插件，实现了在纯粹的WIndows环境下（非虚拟机，非WSL），使用 Hisat2 进行基因组索引构建以及转录本回帖。最近家里事情较多，期间不少时间可以天马行空的想事情。过于具体的生物学问题难以思考出个答案，毕竟是以实践为主。但数据分析上的鬼点子倒是非常合适。
过去几年，正是这类时间，让我能设计出 TBtools/JIGplot，优化出其中各式各样的特性。正如现在 TBtools 的插件模式，也是临时想到的实现方式。
今天躺着，突然想着：
- 目的是矫正基因注释
- 手段是在我改造的基因浏览器 IGV-GSAme 矫正
- 输入是基因组，待矫正的基因结构注释以及RNA读段回帖的BAM
- 操作是基于RNA的Alignments，手动调整注释
那么问题来了，要在windows完成全部工作，我们会遇到几个问题
- IGV的特性不足，通过 IGV-GSAme 已经解决
- 转录组回帖，通过 TBtools 的 Hisat2 插件也解决了
- 基因组局部区域的有参考组装，无解!
既然无解，那我完全可以鼓捣一个windows下的stringTie，中间做个接口，那么就可以实现局部组装（注意，指定一个区域组装，常常反而能组装出准确的结果，具体自行思考）。千里之行始于足下，在让 IGV-GSAme 变得更强之前，先做一个简单的东西，TBtools插件。
StringTie Wrapper - 新的 TBtools 插件
一共两个对应的是 Stringtie 两个主要功能：
- Stringtie Assembly : 转录组组装
- Stringtie Quantify : 转录本表达量估计
StringTie Assembly 插件的使用
对于组装一步，参数简单，用户只需要提供排序好的BAM文件即可，这些文件，事实上可以通过前几天推的 Hisat-build 和 Hisat-align 插件来获取。需要注意的有三点：
- 参考物种基因结构注释是可选的
- 设置输出目录而不是输出文件，因为组装时是单个bam文件单独组装，最后再进行一次merge，得到最终可用的 GTF 文件（具体Fasta序列提取，可直接使用 TBtools 的 GXF Sequence Extract，请参考公号前述推文）
-
并行线程数，应该注意，此处的并行线程数与Stringtie软件的线程数并不等价。（我调整了stringtie源码，编译并使其可以在windows下运行，但windows系统限制，所以只能单线程，且速度上不来。这没关系，我们可以多个文件同时组装，这样也就只需要使用stringtie的单线程模式，毕竟很多时候，我们并不可能做一个样品的转录组测序和组装 - PS：windows下可能会慢不少，比如6G的转录组，估计组装时间大概要到 1个小时，在我的笔记本上。不过同时跑2个，那么也是1个小时嘛..）
组装结果大体如下，我做了两个实际数据的，
StringTie Quantify 插件的使用
使用简单，用户需要的注意的几乎只有三点：
- 排序好的BAM文件
- 一个必须的基因结构注释文件，可以是gff3也可以是gtf，比如使用 StringTie Assembly插件整理的组装结果。
- ReadLength, 这一参数即测序读长。因为StringTie计算的其实是Coverage，并没有读段计数这一步。常见的操作是简单地基于Coverage反推raw counts。于是read length成为必要。
整体上会输出六个矩阵，具体大伙自己看名字就知道是啥。
即，转录本水平或基因水平的Counts，FPKM，TPM矩阵。可查看其中某个。
注意到，我前面做StringTie Assembly的时候设置了参考注释，所以AcoXXXX等ID为原始注释ID（事实上是没有被组装出来的，一般是覆盖率极低），而MSTRGXXXX等为已有注释中被当前样品覆盖以及新注释出来的基因。
PS：四个插件将会一并上线至插件商店，暂时票价应该会定位 100，打包估计 365，具体再定。
感兴趣的，想上车的，请参考前述《Plugin | 高速版插件商店！我又有一个绝妙的 idea》推文。
写在最后
现在是大年三十晚上九点，也算是在新春到来之时，了却一个鬼点子。
在此祝大伙新春快乐，牛年大吉！
