一、背 景
PacBio最新三代测序仪Sequel II芯片实现了更高通路，同时已经支持barcode测序，这样方便混合多个组织、处理、物种等样本。
那么如何从pooling的数据中demultiplexing各个文库/样本的数据是需要考虑的问题。
早前，已经有开发者打造了一款用于数据拆分的软件，即lima。
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github链接为： https://github.com/pacificbiosciences/barcoding
lima是针对PacBio单分子测序数据的一款标准的识别barcode序列的工具，从 SMRT Link v5.1.0就开始引入，使用简单，处理速度很快（500G原始subreads拆分约6小时）。可拆分raw subreads和CCS reads。
二、文库结构
由于PacBio建库方式与二代测序不同，其建库方式也存在多种形式。
例如，使用序列特异的引物构建哑铃型文库（RNA）：
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更进一步，官方RNA建库流程建库得到引物、barcode序列结构如下：
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由引物和16-bp的barcode组成后接poly T，同时官方提供了24条primer-barcode序列组合，部分序列如下（PacBio官方下载）：
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而，DNA文库结构就简单的多，仅由引物和相同的barcode组成：
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三、拆分及注意事项
那么针对普通DNA的建库测序，其拆分只需要提供barcode序列进行匹配即可，故lima的使用也更为简单：
DNA数据拆分：
lima --split-bam-named in.bam barcode.fasta split.bam
barcode序列文件barcode.fasta:
bc1000
CTCTACTTACTTACTG
bc1001
GTCGTATCATCATGTA
bc1002
AATATACCTATCATTA
而针对RNA建库，由于其添加了5`primer可以用于判断RNA分子是否为全长，其使用方法如下：
lima --split-bam-named in.bam barcode.fasta split.bam
需要注意的是RNA建库的barcode是在逆转录的时候加进去的，序列应当为反向互补的，同时其还存在5` primer，barcode序列文件barcode.fasta:
primer_5p
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGG
bc1017_3p
ATATAGCGCGCGTGTGGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT
bc1018_3p
CACAGTGAGCACGTGAGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT
需要注意，RNA的barcode列表写法，必须有5引物，后缀为_5p，3引物必须有3p作为后缀；5引物是固定的，3引物由引物和barcode构成（反向互补）
拆分完成后会生成拆分后的bam及其索引文件：
split_in.primer_5p--bc*_p3.bam
split_in.primer_5p--bc*_p3.bam.pbi
split_in.primer_5p--bc*_p3.subreadset.xml
其命名以前缀、5-3引物名称连接组成。
