RNase H1

1.结构域

RNases H1存在于原核生物、真核生物和逆转录酶中。RNases H1的催化结构域包含约150个氨基酸。在大多数细菌RNases H1中,不存在其他结构域。真核RNase H1则具有N端线粒体靶向序列(MTS),该蛋白以两种亚型表达,分布定位于细胞核和线粒体。此外,真核RNase H1还包含一个额外靠近N端的约50个氨基酸区域,称为杂合结合域(hybrid binding domain, HBD)。在几种细菌(Shewanella sp. SIB1和Bacillus halodurans)中也发现了具有杂合结合域的RNase H1。HBD通过RNase H1活性所需的自由接头连接到C端催化结构域 上。该接头区域在序列和长度方面是物种中最不保守的(从B. halodurans的10个氨基酸到人类的64个氨基酸和黑腹果蝇的150个氨基酸)。该区域提供了显著的灵活性,并允许N端和C端结构域相对于彼此重新定位。在人类酶中,它允许HBD和催化结构域最大分离 200 Å,相当于∼60 nt。HBD给真核RNases H1提供了一种独特的底物切割模式。酵母、小鼠和人类酶中该结构域的缺失导致它们失去持续合成能力并以分散方式切割长RNA/DNA底物,类似于没有HBD的大肠杆菌RNase H1。这也提出了一种进行性RNA切割的模型,即一个HBD介导的RNase H1与底物结合时会发生多个水解事件,从而形成很容易与DNA解离的短RNA片段。RNA的这种进行性切割对于长RNA/DNA杂合链底物的降解至关重要。

2.生化特性

RNase H1催化RNA/DNA杂交链中RNA链的磷酸二酯键的水解。切割需要至少4个连续的核糖核苷酸。对于这样的最小底物,主要的切割位点位于RNA片段的中间。人类酶对Mg2+浓度和pH值呈钟形反应曲线,最佳条件为1mM Mg2+和pH 7–8。Mn2+也支持水解,但它会受到Ca2+的抑制。除了对RNA/DNA杂交链的强烈偏好外,细菌和人类RNase H1还可以结合具有较低微摩尔亲和力的双链RNA (dsRNA),但无法切割此类底物。人类HBD以亚微摩尔Kd结合RNA/DNA杂交链,与dsRNA和dsDNA的亲和力分别低25倍和100倍。此外,HBD的存在显着影响RNase H1的活性没有HBD的大肠杆菌RNase H1的切割速度比人类酶快30倍。此外,从人类RNase H1中删除HBD会导致更高的周转率和与大肠杆菌相似的切割模式,这表明真核RNase H1的催化速度较慢是由于底物进行性水解造成的。

3.已知功能

大肠杆菌RNase H1基因于1983年被克隆获得。1型RNase H通过防止特征性RNA/DNA-DNA杂合体(称为R-loops)的积累参与维持基因组稳定性。这些三链核酸结构在新生转录位点形成,包含新合成的RNA,该RNA与其模板DNA结合,而被置换的非模板DNA链保持单链。据推测,RNase H1向R-loops的募集可能是由SSB蛋白介导的。大肠杆菌酶与SSB的保守C末端区域的能够直接相互作用,同时也刺激了核酸酶活性,从侧面证明了这一观点。R-loops的积累会导致严重的基因组不稳定,通常与遗传疾病和癌症有关。因此,有效去除RNA/DNA杂合体对于细胞的正常运作至关重要。RNase H1也已被证明在体内小鼠模型中的mtDNA复制中发挥重要作用。

RNase H1也被确定为DNA样反义药物治疗的关键效应物。这种治疗方法使用合成的18-20 nt单链核酸(反义寡核苷酸[ASO])。大多数反义药物通过RNase H1依赖性切割发挥作用。由序列特异性ASO与靶mRNA杂交形成的双链体是普遍存在的RNase H1的底物,其切割mRNA链,导致靶基因表达的转录后下调,据报道效率为80-95%。在过去的几十年中,人们做出了巨大的努力来提高ASO的稳定性、结合亲和力和特异性,比如gapmer技术。 迄今为止,两种2'MOE PS-gapmer ASO药物已获批准,许多其他第二代ASO目前正在进行临床前或临床试验。

4.催化结构域的结构

RNase H1的第一个晶体结构是1990年用大肠杆菌酶确定的。目前,12种不同的RNase H1催化结构域的结构存放在PDB中,包括病毒、细菌、古细菌和哺乳动物。没有一个可用的结构代表带有HBD的全长RNase H1。然而,人类RNase H1的HBD与RNA/DNA杂合体复合的结构已得到解决。尽管大肠杆菌和人类蛋白质之间只有34%的氨基酸序列同一性,但细菌和真核RNase H1的总体折叠是相似的。催化结构域采用典型的RNase H折叠。三个α螺旋存在于中央β折叠的一侧:αA加强β折叠,位于β3和β4之间,αB和αD位于β4和β5之间。DEDD基序的保守活性位点残基位于β1中间(第一个 D)、αA内(第二个 E)和β4末端(第三个 D)第四个残基位于人类和大肠杆菌RNase H1中存在的C末端螺旋E。该螺旋相对于其他螺旋位于β-折叠的相对侧。B. halodurans RNase H1缺少α-螺旋 E,其第四个保守的Asp残基位于延伸环上。

大肠杆菌、人类和Mo-MLV RNases H1在α-螺旋 B之后具有一个额外的α螺旋 C。它与后面的环一起形成DNA识别的特征表面,称为基本突起(basic protrusion)。来自B. halodurans和HIV-1的RNase H1蛋白不存在该结构。

5.底物识别

来自B. halodurans和人类RNase H1与RNA/DNA杂交体复合物的的共晶结构揭示了底物识别的特定特征。该酶通过高度保守的残基(人类酶的N151、N182和Q183)沿底物的小沟与RNA/DNA相互作用,形成约8.5 Å的脊。在B. halodurans、LC11和HIV-1 RNases H1 中也显示出类似的相互作用。脊位于酶的两个浅槽之间。一个凹槽容纳RNA骨架,另一个凹槽结合DNA骨架。RNA链识别的机制在不同的RNase H1中是保守的。在包含活性位点的RNA结合槽处,四个连续(对于LC11 RNase H1不连续)核糖核苷酸的2'-OH基团与蛋白质形成接触。由于蛋白质链的主链原子主要参与相互作用,因此提出RNA结合由折叠的整体形状指导,而不是该区域内的特定氨基酸序列

DNA结合沟由一个或两个相互作用区域组成,具体取决于物种。所有酶共有的关键DNA结合位点是磷酸盐结合袋,包括αA的N端区域和两个环(一个在螺旋αB和αD之间,另一个在β1和β2链之间)。在人类RNase H1中,参与DNA结合的残基是R179、T181和N240。磷酸盐结合袋与DNA的磷酸基团相互作用,该基团距离RNA易裂磷酸盐2 bp。磷酸盐结合口袋处的DNA结合会导致磷酸二酯骨架变形。α和γ扭转角从理想值扭曲了~150°,这导致了糖褶的B形构象。这种构象对于RNA是不可用的,因此提出了DNA的灵活性来指导识别杂合体的未切割部分,从而区分出不做为底物的dsRNA

在具有基本突起的RNases H1中,存在第二个DNA结合位点。该位点是RNase H折叠的核心和突起之间的通道。该元素的重要性首先在突变研究中得到证实。在与RNA/DNA复合的人RNase H1的结构中,DNA链位于通道中。碱性突起的W221残基的吲哚环与DNA的脱氧核糖环之间形成堆叠相互作用。如果核糖环中存在2'-OH基团,则这种堆叠相互作用会受到干扰,从而阻止RNA适合第二个结合位点。这为未切割链中的DNA提供 RNase H1选择性的额外机制。同时,突起的基本特征促进酸性底物通过非特异性相互作用吸引到酶上

6.活性位点和催化机理

活性位点的核心是由人蛋白中所有RNase H1:D145、E186和D210三联体形成的。突变研究证实,这些残基对酶活性至关重要。第四个保守的Asp残基(人类中的D274和B. halodurans中的D192)位于C-末端αE内(在B. halodurans的C-末端环中)。与DEDD基序的前三个残基相比,该氨基酸的取代能保留酶的部分活性。

RNase H1对RNA 切割涉及SN2型磷酸转移反应,立体化学研究首次揭示了这种反应。切割开始于去质子化水分子对RNA链的易裂磷酸盐的in-line亲核攻击。然后形成五共价中间体,该中间体涉及磷酸酯立体构型的反转。在3′离去基团被另一个水分子重新质子化后,形成5′磷酸基和3′-OH基团,产物从裂解位点释放。

催化需要二价金属离子,优选Mg2+。在B. halodurans RNase H1的酶-底物复合物的晶体结构中,两个Mg2+离子位于活性位点(命名为A和B)。有趣的是,离子的正确定位需要底物结合,因为在载脂蛋白晶体中没有观察到离子,并且当底物变形时它们不在正确的位置上。

Mg2+离子的配位几何支持双金属离子催化机制,该机制最初由Steitz提出。根据该模型,两个金属离子相隔∼4 Å,位于底物RNA链的易裂磷酸盐的两侧。离子不对称配位并参与反应的不同阶段。金属离子A被认为是攻击亲核试剂的定位和活化所必需的,金属离子B被认为是通过破坏酶-底物复合物来促进裂解。

B. halodurans RNase H1-RNA/DNA复合物的结构中,Mg2+离子A 由六个配体(D71、D192和D132来自活性位点、易裂磷酸盐的pro-Sp非桥连氧原子和两个水分子)配位配体呈接近理想的八面体几何形状,这是Mg2+的特征。Mg2+离子A定向并激活位于离磷酸盐的pro-Rp氧3 Å处的亲核水,紧邻3' 到易裂键。这种磷酸盐的硫代磷酸酯取代使大肠杆菌RNase H1的催化活性降低了86%。攻击性亲核试剂可以是OH-离子或水;对于后者,需要发生去质子化,例如通过质子迁移到易裂磷酸盐的Rp并迁移到溶剂。Rosta等人提出了质子转移的两步模型。这个假设首先来自水分子的质子被转移到易裂键下游的磷酸盐上以产生中间体;然后,用活性位点Asp残基之一作为质子供体进一步质子化离去基团。Mg2+离子B有五个配位体,采用不规则的配位几何结构:来自活性位点的D71、E109、D132以及易裂磷酸盐的pro-Sp和3'离去基团氧原子。金属离子B的这种不利几何形状被认为是使反应转向产物形成的驱动力五配体配位使酶-底物复合物在能量上不稳定,在产物形成时改变规则的八面体配位将促进裂解。事实上,与底物、反应中间体和反应产物(代表双金属离子催化过程中不同阶段)结合的B. halodurans RNase H1的共晶结构揭示了B处配位环境的基本重组。亲核攻击被证明需要金属离子靠得更近(从酶-底物复合物中的“静止”距离∼4 Å 到过渡态中的∼3.5 Å),这使亲核水靠近易裂磷酸盐的磷原子,从而形成过渡态。有趣的是,这种阳离子运动可以很容易地通过Mg2+离子而不是Ca2+离子来完成,这可能是因为更大的原子半径,这可以解释后者对RNase H1活性的抑制以及酶对Mg2+离子的偏好。

裂解后,产物的5'磷酸盐从活性位点去除,二价金属离子之间的距离增加到∼4.8 Å,这甚至比底物结合时更远。Mg2+离子A现在由保守的D192和五个水分子协调。重要的是,B位Mg2+移动了0.9 Å,并通过六个配体:D71、E109、D132、产物的3'-OH和两个水分子以更规则、能量有利的八面体几何形状配位。

活性位点处易裂磷酸盐的定位与A和B位点处的两个金属离子之间的强相互依赖性,确保了仅在适当的底物上发生切割。此外,细菌和真核RNases H1的突变研究证实了金属离子B积极参与催化。虽然取代保守的Mg2+离子A配位Asp部分被Mn2+依赖性活性所拯救,但与Mg2+离子B配位的残基的相应突变则导致酶完全失活。这些结果支持金属离子B的作用是有效促进磷酰基转移反应而不是过渡态的被动稳定化的假设,这在之前已经提出。

Samara和Yang的一项研究揭示了RNase H1催化的典型双金属离子模型。对晶体中的逐步RNA/DNA裂解进行广泛分析(在PDB中沉积了56个结构),表明水解涉及独特的单价和二价阳离子运输在复合物的活性位点观察到额外的离子,并且离子组成在随后的反应步骤中发生变化。在酶-底物复合物中Mg2+离子A和B结合后,额外的K+被募集到U位点,该位点与亲核水分子和3'磷酸盐相配位。正确的底物排列需要在W位点有另一个单价阳离子,协调易裂磷酸盐的pro-Rp氧。此外,K+离子U在C位被第三个二价离子取代。Mg2+离子C由四个水分子、3'磷酸的pro-Rp氧和亲核氧配位。这种离子组成对于水去质子化、亲核攻击和产物形成至关重要。产物释放伴随着瞬时结合的Mg2+离子C立即被V位点的单价阳离子取代,然后被有序的K196残基取代,从而稳定了5'磷酸盐。

除了DEDD基序之外,高度保守的组氨酸残基在催化中也起着重要作用。在人类RNase H1中,H264位于β5和αE之间的活性位点附近的柔性环中。大肠杆菌RNase H1中的相应残基对于切割至关重要,H124A突变体导致酶活性降低100倍。在B. halodurans中,保守的组氨酸被Glu取代,Glu位于β5之后的环上。基于具有RNA/DNA底物的酶的晶体结构,该残基被提示为通过扰乱金属离A的配位并在切割后使5'磷酸位错位来促进产物从活性位点释放。

7.HBD的结构:杂合链特异性识别机制

HBD的结构首先是针对酵母蛋白确定的,然后是针对人类蛋白确定的。HBD由一个三链反平行β-折叠和两个α-螺旋组成,顺序为ββαβα。与RNA/DNA杂合链复合的人HBD的晶体结构揭示了核酸结合的模式。两个连续核糖核苷酸的2'-OH基团与位于αA和β3之间的环中的残基R52和A55的骨架羰基形成氢键。

DNA链结合在HBD的浅槽中,其中只有少数极性残基与底物直接接触。保守的Y29和K60与DNA链的两个连续磷酸盐相互作用。这些相互作用对于酶的亲和力和活性都至关重要。两个保守的残基W43和F58位于DNA结合槽。它们的芳香环与DNA的脱氧核糖环形成堆叠相互作用。在RNA链结合的情况下,核糖的2'-OH基团将与W43和F58的芳香环发生冲突,导致相互作用效率降低。因此,这些相互作用解释了HBD对结合RNA/DNA异源双链的DNA链的偏好

8.逆转录酶中的RNase H结构域:功能和机制的简要概述

逆转录是移动元件增殖的关键步骤,移动元件称为长末端重复 (LTR) 逆转录转座子,以及从它们进化而来的逆转录病毒(例如 HIV-1)。逆转录是一个多步骤过程,涉及将ssRNA转换为dsDNA,并由多结构域逆转录酶执行。逆转录酶表现出DNA聚合酶和RNase H活性,两者都是反应执行所必需的。聚合酶结构域位于酶的N末端,而1型RNase H结构域存在于C末端区域。在逆转录过程中,中间的RNA/DNA杂合体形成,RNase H活性去除模板RNA链以允许其被DNA取代

逆转录酶有各种不同的结构。例如,Ty3逆转录酶是同型二聚体,其中两个亚基具有不同的构象。二聚体的形成是由底物结合诱导的。逆转录病毒的逆转录酶可以是单体的,例如小鼠莫洛尼白血病病毒 (MMLV) 逆转录酶,也可以形成二聚体,例如HIV1逆转录酶。后者包含一个具有聚合酶和RNase H活性的较大亚基(p66) 和一个较小的亚基 (p51),p51是p66的截短形式,它没有RNase H结构域但发挥结构性作用。

逆转录酶的RNase H结构域的进化非常复杂。逆转录酶RNase H结构域的祖先形式存在于LTR逆转录元件中,其结构在几个方面与细胞对应物不同。然而,活性位点是具有相同配置的。在逆转录病毒中,存在一个从细胞中获得的新RNase H结构域,而祖先的RNase H结构域失去其活性并成为结构性连接结构域。这个过程可能独立发生了好几次,这方面的证据是一些逆转录病毒RNase H结构域包含基本突起(例如,MMLV的逆转录酶),而另一些则缺乏它(例如,HIV-1的逆转录酶)。孤立的RNase H结构域通常是无活性的(例如Ty3和HIV-1的结构域),但有些能够切割底物(MMLV的RNase H)。

与RNA/DNA底物复合的HIV-1酶的结构有很多,但最近才报道了第一个具有与RNase H催化相互作用的RNA/DNA杂合体的结构。最近的结构表明RNA易裂磷酸盐和RNase H活性位点之间的相互作用与细胞酶中的相互作用基本相同。杂合体和RNase H活性位点之间的催化相互作用需要聚合酶和RNase H结构域之间的底物变形。这种变形主要涉及双面展开。这证明了逆转录机制的一个重要方面,即聚合酶和RNase H活性之间的协调。底物在RNase H活性位点上不是组成型的,并且构象变化(其性质取决于逆转录酶的结构)需要发生,以使RNase H切割发生。这允许酶微调RNase H活性并在需要时实现特异性切割。众所周知,HIV-1逆转录酶的RNase H结构域在相对于切割位点的几个确定位置表现出对核苷酸的序列偏好。

鉴于HIV-1耐药问题的持续存在,RNase H结构域或可成为抗病毒药物开发的重要靶点。今天使用的抗HIV药物是靶向逆转录酶或其他两种酶的聚合酶结构域,但没有靶向逆转录酶的RNase H功能的药物。鉴定RNase H结构域的潜在抑制剂的工作正在展开研究。

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