本文以白细胞介素6为例，介绍基因工程重组质粒构建的一般步骤。
1.准备
本文使用到的两个软件为Vector-NTI-Advance和snapgene：
Vector-NTI-Advance可在http://en.freedownloadmanager.org/Windows-PC/Vector-NTI-Advance.html下载安装；snapgene在 https://www.snapgene.com/ 下载安装免费试用版本。
2.相关DNA或RNA的寻找
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中可以找到相关DNA或RNA
本文所使用的是白细胞介素6（IL-6）对应mRNA:Human interleukin 6 mRNA, complete cds Accession: M54894.1 GI: 186351
网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M54894.1
使用Vector-NTI-Advance打开后如图
3.结构基因的确定
点击左侧栏中的feature map，然后点击CDS文件夹，可以发现，其51-689bp区间为其结构基因，故截取该段基因作为目的基因，接下来即将该段目的基因转移到载体上
（CDS是Coding sequence的缩写，是编码蛋白产物的序列，是结构基因组学术语）
鼠标框选区段即为目的基因区段
4.选择质粒
质粒可在snapgene的官网序列库中找到，本文选取pET-30b(+)作为载体
下载后为dna格式
用snapgene打开后可以看到如图结构
5.酶切位点的选择
从图谱中选择多克隆位点区域MCS，点击，并转到序列页面
同时新建DNA序列，将上文提到的目的基因的序列粘贴进去，用于后续的酶切位点分析
1.打开SnapGene，点击New DNA File，弹出以下窗口：
need-to-insert-img
在Create the following sequence窗口下输入DNA序列，并对该文件命名，点击OK。或是 点击Import from Genebank，输入NCBI中某序列的access number，点击OK。
2．此时弹出如下窗口：
need-to-insert-img
3.对该序列进行注释：点击Features→Add Feature，对该序列进行命名注释。
△创建质粒图谱文件方法相同。
酶切位点分析
双酶切连接的酶需要满足以下要求：
1.酶切位点需要存在于MCS中，但同时不能存在于目的基因序列中。
2.两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔，不能紧邻或重叠。
3.最好选择成熟的内切酶。
按照以上原则，筛选酶切位点
本文筛选了BamHI和HindⅢ两个具有相同buffer的酶切位点
6.设计引物
1）PCR引物绘制：打开上文建立好的目的基因文件，在目的基因两侧截取15-30bp序列，点击Primers→Add primers，选择top strand或bottom strand。起始端选择top，终止端选择bottom。
选择的酶切位点为上文中根据质粒筛选的酶切位点
末端引物类似，但要除去终止子
7.扩增
设计好引物后，按CTRL+D或在工具栏中使用PCR进行扩增。进入如图页面：
通过shift键选择两个引物，点击右下角PCR按钮，得到扩增序列。
8.重组质粒构建
点击Actions→Insert Fragment，用键盘Shift键点选上文提到的两个酶切位点，点击Insert，在source of fragment处选择插入的目的片段来源。
将扩增后的目的基因文件拖动到插入框中，在右边栏中选择酶切位点，点击右下角得到重组质粒。
snapgene的部分操作可以参考
http://www.sci666.net/59928.html
