T细胞受体库测序

T细胞受体是T细胞识别靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子,由α链和β链(分别由TRA和TRB编码)或者γ链和δ 链(分别由TRG和TRD编码)构成的异二聚体,主要是以α链和β链构成的异二聚体为主。α链和β链由恒定区(C区)、可变区(V区)、跨膜区及胞质区等组成,V区是特异性识别抗原肽/组织相容性抗原复合物(MHC)的关键部位。α链和β链的V区均含有3个高变区,又称互补决定区(CDR),分别为CDR1,CDR2,CDR3,而β链还有CDR4,CDR3是负责识别processed antigen的主要CDR。

tcr1.png

tcr2.png

TCR多样性超级丰富,可达10^15 - 10^18种,所以机体才有可能识别任何抗原。那么TCR多样性的产生原因是什么呢?
TCR多样性主要是V(D)J重组导致,这是一个随机过程,而V,D,J基因本身又具有多样性,不同的T细胞克隆经基因重排、发生不同基因片段的连接,产生特定的(VDJ)基因和(VJ)基因,从而表达特异性TCR,这是TCR多样性产生的主要机制。
TCRα链通过VJ重组产生,而β链通过VDJ重组产生;同样地,TCRγ链的产生涉及VJ重组,而TCRδ链通过VDJ重组产生。

tcr3.png

正常个体在没有抗原刺激的情况下,TCR基因重排是随机的,T细胞呈多家族、多克隆性特点。接受不同抗原刺激后,TCR V区基因可对抗原产生特异性识别,并使带有这类基因的 T细胞得到优势扩增。
TCR测序方法:
一、以DNA为起始材料,采用多重PCR方法扩增TCRβ CDR3片段:


多重pcr.jpg

二、以RNA为起始材料,采用5’RACE方法扩增全长TCR序列:


719bd169783e0912a2162aba.jpg

分析软件:mixcr
这是一款非常好用的TCR测序分析软件,适用于多种实验方法,包括多重PCR,5’RACE以及RNAseq和WES数据,用法也非常简单。
对于多重PCR方法,该软件分析命令如下:

mixcr analyze amplicon --species hs \
        --starting-material dna \
        --5-end v-primers \
        --3-end j-primers \
        --adapters adapters-present \
        input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

对于5’RACE方法,该软件分析命令如下:

mixcr analyze amplicon --species hs \
        --starting-material rna \
        --5-end v-primers \
        --3-end j-primers \
        --adapters adapters-present \
        input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

TCR测序主要应用于:
(1)V、D、J基因片段使用频率,CDR3 长度,插入及缺失碱基比例、CDR3氨基酸使用模式,不同抗原受体序列丰度及文库的多样性、克隆性;
(2)检测并了解克隆性增生或抗原特异性的T细胞的特征;
(3)追踪不同时间点疾病相关T细胞克隆变化;
(4)通过TCR氨基酸序列研究不同个体间的共有免疫细胞克隆。

相关概念:
有效TCRβ序列:
CDR3核苷酸序列及CDR3氨基酸序列:
相同TCRβ链CDR3序列称为一种克隆型:每种克隆型的序列数及频率:
多样性:VJ组合、VDJ组合、CDR3核苷酸克隆型数量、CDR3氨基酸克隆型数量:

TCR多样性比较指标:香农熵,数值越接近 0 表明免疫多样性越差,而越接近 1 表明免疫多样性越好。
高克隆序列(Highly enpended clone, HEC),高克隆序列是指表达量超过了总的 CDR3 序列的 0.5%的 CDR3 序列。
CDR3 氨基酸长度正态拟合:正常机体中, CDR3 氨基酸的长度呈正态分布, 然而在患有疾病的患者中, 其中一些特定的 CDR3 氨基酸序列会出现大量的表达,使 CDR3 氨基酸长度出现明显的差异。
基因使用频率分布:

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