不同数据集联合分析
选择了通过四种技术产生的人胰岛细胞数据集：CelSeq（GSE81076) CelSeq2（GSE85241），Fluidigm C1（GSE86469）和SMART-Seq2（E-MTAB-5061）。我们在此处(数据)提供组合的原始数据矩阵和相关的元数据文件以便开始。
数据集预处理
加载表达式矩阵和元数据。元数据文件包含四个数据集中每个单元格的技术（tech列）和单元格类型注释（cell type列）。
library(Seurat)
pancreas.data <- readRDS(file = "../data/pancreas_expression_matrix.rds")
metadata <- readRDS(file = "../data/pancreas_metadata.rds")
为了构建参考，我们将识别各个数据集之间的“锚点”。首先，我们将组合对象拆分为一个列表，每个数据集都作为一个元素。
pancreas <- CreateSeuratObject(pancreas.data, meta.data = metadata)
pancreas.list <- SplitObject(pancreas, split.by = "tech")
在找到锚点之前，我们执行标准预处理（对数标准化），并为每个锚点单独识别变量要素。请注意，Seurat v3基于方差稳定转换实现了一种改进的变量特征选择方法（"vst"）
for (i in 1:length(pancreas.list)) {
pancreas.list[[i]] <- NormalizeData(pancreas.list[[i]], verbose = FALSE)
pancreas.list[[i]] <- FindVariableFeatures(pancreas.list[[i]], selection.method = "vst",
nfeatures = 2000, verbose = FALSE)
}
整合3个胰岛细胞数据集
接下来，我们使用FindIntegrationAnchors函数识别锚点，该函数将Seurat对象列表作为输入。在这里，我们将三个对象集成到一个引用中（我们将在后面的小插图中使用第四个）
我们在这里使用所有默认参数来识别锚点，包括数据集的“维度”（30;随意尝试在宽范围内改变此参数，例如在10到50之间）。
reference.list <- pancreas.list[c("celseq","celseq2","smartseq2")]pancreas.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = reference.list, dims =1:30)
然后我们将这些锚传递给IntegrateData函数，该函数返回一个Seurat对象。
返回的对象将包含一个new Assay，它包含所有单元格的集成（或“批量修正”）表达式矩阵，使它们能够被联合分析。
pancreas.integrated <- IntegrateData(anchorset = pancreas.anchors, dims =1:30)
运行后IntegrateData，该Seurat对象将包含一个Assay带有集成表达式矩阵的new 。请注意，原始（未校正的值）仍存储在“RNA”分析中的对象中，因此您可以来回切换。
然后我们可以使用这个新的集成矩阵进行下游分析和可视化。在这里，我们扩展集成数据，运行PCA，并使用UMAP可视化结果。集成数据集按单元格类型而不是技术集群。
library(ggplot2)
library(cowplot)
# switch to integrated assay. The variable features of this assay are automatically set during Integrate Data#
DefaultAssay(pancreas.integrated) <-"integrated"
# Run the standard workflow for visualization and clustering
pancreas.integrated <- ScaleData(pancreas.integrated, verbose =FALSE)
pancreas.integrated <- RunPCA(pancreas.integrated, npcs =30, verbose =FALSE)
pancreas.integrated <- RunUMAP(pancreas.integrated, reduction ="pca", dims =1:30)
p1 <- DimPlot(pancreas.integrated, reduction ="umap", group.by ="tech")
p2 <- DimPlot(pancreas.integrated, reduction ="umap", group.by ="celltype", label =TRUE,repel =TRUE) + NoLegend()
plot_grid(p1, p2)
使用集成参考的细胞类型分类
Seurat v3还支持将参考数据（或元数据）投影到查询对象上。虽然许多方法都是守恒的（两个程序都以识别锚点开始），但数据传输和集成之间存在两个重要区别：
在数据传输中，Seurat不会更正或修改查询表达式数据。
在数据传输中，Seurat有一个选项（默认设置）将参考的PCA结构投影到查询上，而不是学习与CCA的联合结构。我们通常建议在scRNA-seq数据集之间投影数据时使用此选项。
在找到锚之后，我们使用该TransferData函数基于参考数据（参考单元类型标签的向量）对查询单元进行分类。TransferData返回具有预测ID和预测分数的矩阵，我们可以将其添加到查询元数据中。
pancreas.query <- pancreas.list[["fluidigmc1"]]
pancreas.anchors <- FindTransferAnchors(reference = pancreas.integrated, query = pancreas.query, dims =1:30)
predictions <- TransferData(anchorset = pancreas.anchors, refdata = pancreas.integrated$celltype, dims =1:30)
pancreas.query <- AddMetaData(pancreas.query, metadata = predictions)
因为我们从完整的综合分析中获得了原始标签注释，所以我们可以评估我们预测的细胞类型注释与完整参考的匹配程度。在这个例子中，我们发现细胞类型分类有很高的一致性，超过97％的细胞被正确标记。
pancreas.query$prediction.match <- pancreas.query$predicted.id == pancreas.query$celltype
table(pancreas.query$prediction.match)
##
## FALSE TRUE
## 16 622
为了进一步验证这一点，我们可以检查特定胰岛细胞群的一些经典细胞类型标记。请注意，即使这些细胞类型中的一些仅由一个或两个细胞（例如ε细胞）表示，我们仍然能够正确地对它们进行分类。
table(pancreas.query$predicted.id)
##
## acinar activated_stellate alpha
## 21 17 248
## beta delta ductal
## 258 22 33
## endothelial epsilon gamma
## 13 1 17
## macrophage mast schwann
## 1 2 5
VlnPlot(pancreas.query, c("REG1A","PPY","SST","GHRL","VWF","SOX10"), group.by ="predicted.id")
