Nature | 巨噬细胞激活促进乳腺-脑转移瘤产生药物抗性

原创 骄阳似我 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：49.962 

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本文在小鼠乳腺-脑转移模型中，使用集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂BLZ945，在转移级联的不同阶段靶向TAM，可在预防和干预临床前试验中产生抗肿瘤反应。然而，在已证实的脑转移瘤中，代偿性CSF2Rb–STAT5介导的促炎性TAM激活通过诱导与促进肿瘤复发的伤口修复反应相关的神经炎症基因特征减弱了CSF1R抑制的最终疗效。因此，通过AC4-130阻断CSF1R并抑制STAT5信号，可导致持续的肿瘤控制、小胶质细胞激活状态的正常化和神经元损伤的改善。

脑转移瘤（BrM）是成年人最常见的颅内肿瘤，10–40%的癌症患者发生BrM。黑色素瘤、乳腺癌和肺癌的BrM发病率最高。尽管颅外原发肿瘤的治疗取得了进展，但播散性疾病的治疗选择仍然有限，主要依赖于包括手术切除、放疗和/或化疗在内的多模式方法。免疫疗法在几种非脑肿瘤中的成功使人们对脑肿瘤（包括胶质母细胞瘤和BrM）的更有效治疗选择相当乐观。然而，作为侵袭性原发性脑肿瘤的单一疗法，旨在激活针对肿瘤细胞的T细胞反应的策略在很大程度上失败了，并且根据原发性肿瘤类型，在BrM患者中显示出低或中度疗效。不良反应率可部分归因于中枢神经系统（CNS）的高度免疫抑制环境。

TAM是乳腺BrM中一种丰富的非癌细胞类型，起源于脑驻留小胶质细胞（TAM-MG）或单核细胞衍生巨噬细胞（TAM-MDM），在BrM中表现出免疫调节表型。TAM也被证明能促进远处癌细胞的外渗。因此治疗性靶向TAM代表了一种有吸引力的策略，可以阻断肿瘤-基质相互作用，并调节针对癌细胞的免疫反应。针对特定TAM群体的遗传学方法表明TAM-MG在BrM进展中起着重要作用。此外，临床前研究表明，使用CSF1R抑制剂的TAM导向疗法降低了乳腺癌细胞的侵袭，并对胶质母细胞瘤、黑色素瘤-BrM和脑内注射的4T1乳腺癌细胞产生了抗肿瘤效果。然而，以前在BrM模型中的研究评估了TAM在遗传或药物干预后单个时间点的靶向效应，而没有询问长期疗效或潜在的适应性耐药机制和不良反应。

近期，在Nature杂志上发表了一篇名为“Compensatory CSF2-driven macrophage activation promotes adaptive resistance to CSF1R inhibition in breast-to-brain metastasis”的文章，评估了纳入BrM不同阶段的不同临床前试验设计中TAM靶向疗法的疗效。

首先分析了不同原发肿瘤患者BrM组织阵列中CSF1R+细胞的丰度，包括小细胞肺癌（SCLC）、非小细胞肺癌（NSCLC）、肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌和乳腺癌。观察到CSF1R+免疫细胞在所有分析的BrM病变中高度浸润。在这些样本中，CSF1R+细胞与IBA1表达有相当大的重叠，表明大多数CSF1R+细胞来源于单核细胞/巨噬细胞系。对乳腺癌BrM和NSCLC BrM全组织切片的分析证实，在TAM-MG和TAM-MDM中，CSF1R的表达比例很大，而CSF1R+的非免疫细胞很少。图1：CSF1R在人和小鼠脑转移瘤中的表达。

接下来测定了异种移植物MDA BrM和基因99LN BrM小鼠模型中TAM的定位和形态。TAM激活与细胞形态的逐渐变化相关。将MDA BrM肿瘤中的TAM-MG和TAM-MDM分别与具有正常MG或血单核细胞的无瘤动物的相应对照进行比较分析，发现TAM-MG中有966个差异表达基因（DEG），TAM-MDM中有2863个差异表达基因（DEG）；其中500个在两个群体之间共享。对两个TAM群体中富集的500个基因进行了聚类和基因本体分析。与最近对患者脑部恶性肿瘤的分析一致，小鼠TAM-MDM表现出抗原呈递、组织重塑和免疫调节基因集以及有丝分裂和细胞分裂的高表达，而TAM-MG显示出与创伤反应和神经过程调节相关的基因更丰富。在TAM-MG和TAM-MDM中，与中枢神经系统发育、代谢和白细胞募集的负调控相关的信号显示出类似的诱导。图2：小鼠BrM中TAM表现出炎症表型。

接下来试图研究初次接触MG后BrM细胞命运的后果，并采用使用血脑屏障（BBB）渗透性CSF1R抑制剂BLZ945的MG消耗策略。从载体处理的小鼠分离的脑切片中的MG显示出朝向外源性添加的99LN BrM细胞的定向运动，延伸突起以观察癌细胞表面。为了评估体内BBB中是否存在明显的BrM细胞与MG的相互作用，在心内注射BrM细胞之前用BLZ945或赋形剂治疗小鼠7天，并分析其外渗情况。观察到BLZ945治疗的动物在24和48小时内99LN BrM细胞外渗显著减少。在48小时的MDA BrM模型中观察到类似的结果。与体外分析一致，在BLZ945处理的小鼠中检测到BrM细胞和MG在外渗部位的直接相互作用较少。体外BBB分析进一步证实，原代MG或MG细胞系EOC2的加入增加了99LN BrM和MDA BrM细胞系的迁移潜能，BLZ945显著降低了这一潜能。确定BBB迁移受损是否会导致BrM降低发生率或延迟生长，跟踪BLZ945治疗后的BrM进展。评估了99LN BrM和MDA BrM模型的总体存活率，并发现在两种模型中，在BLZ945治疗下发生BrM的小鼠的肿瘤发病显著延迟。这导致在MDA BrM模型中BLZ945治疗动物的中位生存期显著延长。

图3：MG支持转移定植的初始步骤。

在已建立的BrM和分层荷瘤小鼠（初始肿瘤体积相似）中评估CSF1R抑制对载体或BLZ945治疗组的影响。然后每天给小鼠治疗一次，持续7天或直到出现症状。在治疗开始后的第4天和第7天或每周直到试验结束时测量肿瘤进展。通过生物发光成像（BLI）或磁共振成像（MRI）进行的成像显示，BLZ945在大多数治疗动物中阻止了肿瘤的生长，有几只小鼠出现了大型BrM病变的消退。虽然CSF1R抑制导致治疗开始后d4和d7出现初始肿瘤反应，但随后在两种模型中均检测到BrM再生。因此，在两种BrM模型中均未观察到对中位生存率的显著影响。肿瘤细胞中下调的DEG主要与DNA修复、细胞周期或转录调节有关，或代表参与创伤修复、肿瘤生长和侵袭性的受体酪氨酸激酶。基因本体分析进一步证实，细胞周期调控和增殖基因集是BLZ945治疗后MDA BrM下调基因集ORA中的前20条途径之一。值得注意的是，上调的DEG含有多个在CNS细胞中富集的基因。其中，PCDH20、BTBD6和TMEM158分别参与CNS细胞间通讯、神经元分化和神经元存活。基因集富集分析（GSEA）还证明了体内BLZ945治疗后肿瘤细胞中“神经元分化调节”（GO0045666）和“参与神经元分化的细胞形态发生”（GO0048812）基因集的表达变化。组织学评估证实，在99LN BrM模型中，BLZ945处理的动物肿瘤细胞中，GPR153、PCDH20和TMEM158的表达较高。这些数据共同表明了一种神经元模仿的形式，这可能代表了脑转移肿瘤细胞整合到支持细胞存活的CNS细胞-细胞通讯回路的一般特征，在这种情况下，作为对TAM耗竭的适应。图4：CSFLR抑制对肿瘤生长和BrM细胞转录程序的影响。

通过直接比较受BLZ945诱导的细胞死亡保护的TAM亚群（约35%的TAM）的表达与其载体处理的对应物，研究了在CSF1R抑制时介导该表型的假定信号通路。DEG的无偏ORA分析显示，在BLZ945处理的MG中，CSF2Rb-和STAT5相关通路的过度表达，指示从CSF1R到CSF2Rb的转换–STAT5下游信号。观察到MMP14（一种与神经炎症脱髓鞘相关的蛋白酶）产生相关的通路的诱导。此外数据还表明，IL-4驱动的通路增加，这些通路先前与长期抑制CSF1R的复发性胶质母细胞瘤的伤口愈合过程相关。另外，已知CSF2R下游基因的高表达和转录因子的激活也证实了CSF2R信号的激活。为了进一步验证CSF1R阻断导致CSF2Rb–STAT5信号轴的代偿性诱导，比较了载体和BLZ945治疗动物的TAM中的基因表达与MG中已发表的CSF1和CSF2特征。GSEA证实，尤其是BrM中7d BLZ945处理的TAM-MG表达CSF2激活的信号，而载体处理的TAM-MG显示与CSF1激活相关的信号。从用BLZ945治疗超过7天的小鼠分离的样本中，表明补偿性CSF2Rb信号的基因特征仍然很明显。与TAM-MG相比，TAM-MDM在体内CSF1R抑制后缺乏CSF2基因标记富集，尽管两种细胞类型在CSF1R抑制的情况下都显示CSF2靶基因和STAT5转录因子活性上调，在体外对CSF2作出反应并表达CSF2R亚单位Csf2ra和Csf2rb。由于CSF2Rb是CSF2R的常见亚单位，IL3R和IL5R，检查观察到的效应是否由CSF2、IL-3或IL-5介导。图5： CSF1R抑制诱导补偿性CSF2介导的TAM激活。

接下来研究了联合抑制CSF1R和CSF2Rb–STAT5下游信号是否可以阻止BrM在对BLZ945产生初始反应后的再生。选择使用CSF2中和抗体在CSF2水平靶向CSF2Rb–STAT5信号，或使用先前描述的STAT5抑制剂AC4-130在下游靶向CSF2Rb–STAT5信号。与载体组相比，使用CSF2抗体或AC4-130在体内联合阻断CSF1R和CSF2Rb–STAT5通路，可显著改善肿瘤控制。比较这两种方法，发现在试验结束时，在一些动物中，对CSF1R和CSF2的特异性抑制仍然是允许肿瘤生长的，这在结合CSF1R和STAT5抑制时发生频率较低。虽然还观察到，与载体组相比，AC4-130或BLZ945单药治疗最初的生长率降低，但在随后的时间点，这在控制肿瘤生长方面并不有效。同样，单独抗CSF2治疗不会影响肿瘤生长。图6：CSFLR阻断联合CSF2或STATS抑制可增强抗肿瘤控制。

接下来评估了BLZ945单药治疗后促炎细胞因子产生的增加是否会影响神经元表型。评估了正常大脑皮层中囊泡谷氨酸转运体VGLUT1和囊泡GABA转运体VGAT的密度，以研究治疗对兴奋性和抑制性神经递质的影响。观察到所有实验组中VGLUT1-和VGAT阳性小泡的密度相似。这导致VGLUT1/VGAT比率向相对过量的兴奋性VGLUT1小泡方向移动。值得注意的是，观察到在溶媒和BLZ945+AC4-130处理的动物中，VGLUT1/VGAT比率最低，接近正常大脑中的值。为了评估对神经元的潜在影响，利用透射电子显微镜来评估髓鞘和轴突形态的完整性。总之，数据表明，联合靶向CSF1R和STAT5可导致持续的肿瘤控制，伴随着TAM和小胶质细胞群的表型正常化以及观察到的轴突形态的逆转。图7：联合CSFLR和STAT5抑制导致TAM表型正常化。

鉴于肿瘤相关免疫细胞和基质细胞的关键作用，肿瘤微环境靶向疗法代表了与标准疗法或单一疗法相结合的有希望的干预策略。一个主要焦点是开发基于T细胞的免疫疗法，包括免疫检查点阻断和CAR T细胞疗法；然而，许多癌症类型的特点是T细胞含量低或肿瘤中的大多数T细胞不能执行细胞毒性T细胞反应。排除T细胞的肿瘤通常被髓样细胞高度浸润，这与建立允许癌症的免疫抑制环境有关。TAM是原发性和转移性脑肿瘤中最丰富的非癌细胞类型之一，因此代表了一个明显的治疗目标。本文证明了用CSF1R抑制剂BLZ945靶向TAM可延迟脑转移的发生，并导致初始肿瘤反应和已确定转移的暂时停滞。

作者介绍：

Lisa Sevenich

2006年 10月至 2010年4月在德国弗莱堡地区分子医学与细胞研究所攻读博士学位，研究组织蛋白酶在生理过程和疾病发展中的体内功能。2010年9月至2021年10月在斯隆凯特林癌症纪念中心攻读博士后学位，研究项目集中于理解肿瘤-基质相互作用在调控位点特异性转移中的作用。其目的是确定潜在的治疗目标，以改善目前的护理治疗标准，尤其是针对脑转移。2015年8月至今在德国法兰克福斯隆凯特林癌症纪念中心分子医学与细胞研究所担任项目组长。该研究小组主要研究解剖脑转移中先天免疫和过继免疫之间的复杂相互作用，以改善肿瘤微环境靶向或免疫治疗。

参考文献：

Florian Klemm，Aylin Möckl，Lisa Sevenich et al. Compensatory CSF2-driven macrophageactivation promotes adaptive resistance to CSF1R inhibition in breast-to-brain metastasis[J].Nature Cancer | VOL 2 | October 2021 | 1086–1101 |