Liu, J.; Wang, H.; Fan, X.; Zhang, Y.; Sun, L.; Liu, C.; Fang, Z.; Zhou, J.; Peng, H.; Jiang, J. Establishment and application of a Multiple nucleotide polymorphism molecular identification system for grape cultivars. Sci. Hortic. (Amsterdam). 2024, 325, 112642, doi:10.1016/j.scienta.2023.112642.
摘要
葡萄（Vitis L）是中国最重要和最受欢迎的水果之一。然而，葡萄的有效鉴定对国产葡萄的保护和育种者的权利非常重要。在此，我们开发了一种称为多核苷酸多态性（MNP）的新方法，它结合了多重 PCR 扩增和高通量测序的优点，提高了葡萄品种鉴定的效率。我们根据 31 个代表性栽培品种的全基因组测序数据，确定了 582 个通用 MNP 标记并对其进行了筛选。随后，利用多重 PCR 扩增和测序技术构建了 60 个常见栽培品种的 MNP 文库。对 60 种葡萄材料进行配对比较后发现，MNP 标记的识别率很高（大于 99%）。此外，MNP 还能准确区分二倍体和多倍体，有助于葡萄的分子鉴定。总之，MNP 分子鉴定技术为葡萄品种鉴定提供了一条新途径。与 SNP 相比，MNP 无需制作昂贵的基因芯片，从而降低了鉴定成本。此外，MNP 可以在一个试管中完成数千个引物的扩增，并用测序代替聚丙烯酰胺凝胶电泳，与 SSR 相比大大节省了实验耗材和人力。综合来看，所开发的技术具有成本低、效率高的优点，与目前其他鉴定方法相比更具竞争力。该技术有助于资源研究，促进植物育种。
1. 1. 引言
葡萄（Vitis vinifera L，葡萄科）是一种多年生藤本植物，原产于西亚和高加索地区的驯化中心（Dong 等，2023 年）。葡萄于公元前 2 世纪晚期传入中国，至今已有两千多年的栽培历史。由于自然杂交、常规杂交、种苗选择、芽变选择等原因，葡萄的遗传多样性不断丰富，在长期的繁殖和栽培过程中积累了多种变异资源（Wang 等，2023 年）。随着葡萄品种的多样化、栽培面积的扩大以及葡萄入选品种间的频繁交流（Emanuelli et al，2013），葡萄品种的鉴定、分类和命名已成为葡萄产业中的一个重要问题。这也给葡萄种质资源的收集、保存和创新带来了不便。此外，市场混乱等情况也会对育种者的权益造成负面影响。在研究的早期阶段，人们通过形态特征来评估葡萄种质资源的遗传多样性。然而，这种方法耗时长、难度大，而且其效率受到环境条件和人为因素的影响。然而，随着高通量测序和分子生物学技术的快速发展以及全基因组序列数据的可用性（Jaillon 等人，2007 年；Velasco 等人，2007 年），人们发现了多种基于 DNA 的分子标记技术用于葡萄品种鉴定。DNA 分子标记技术，尤其是简单序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）标记，具有周期短、对环境影响小等优点，为葡萄品种鉴定提供了一种有效的方法。例如，由于 SSR 标记具有共显性和高多态性的优点，被广泛应用于葡萄种质资源的遗传多样性分析。1996 年，研究人员利用 4 个 SSR 标记区分了 77 个葡萄品种（Bowers 等人，1996 年）。目前，已开发出一套 30 个 SSR 标记系统，用于识别葡萄品种，构建 DNA 指纹数据库，分析 314 个葡萄品种的遗传多样性（Wang 等，2020 年）。然而，由于 SSR 标记数量有限、检测通量小、数据读取困难等原因，在更大范围内对葡萄品种的鉴定受到限制。Dong等（2010）发现了9对SNP引物，成功区分了16个葡萄品种，表明SNP标记在葡萄品种鉴定和遗传多样性分析中的高效性。最近，Wang 等（2022 年）鉴定了 22 个高质量的等位基因特异性 PCR（KASP）标记，识别了 60 个葡萄 SNP 位点，构建了中国 76 个主要栽培葡萄品种的 SNP 指纹。然而，SNP 标记使用的基因芯片复杂且成本高昂。
然而，葡萄基因组测序技术的出现为葡萄分子育种研究带来了革命性的变化，包括探索葡萄种群的遗传变异、鉴定重要性状位点、研究遗传关系和进化（Myles et al, 2011）。植物品种鉴定--MNP 标记法（GB/T 38,551-2020）是 2020 年 10 月 1 日实施的中华人民共和国国家标准，隶属于中国标准化研究院。多核苷酸多态性（MNP）是由基因组 300 bp 范围内的多个核苷酸组成的标记。MNP 利用多重 PCR 和新一代测序技术扩增和检测样品基因组上的 MNP 标记位点，分析检测数据，确定标记位点。与 KASP 技术相比，MNP 的开发过程大大简化，不需要两轮标记检测。同时，聚合酶链反应（PCR）和样品多重分析的通量也大大提高。使用 MNP 技术的单管 PCR 反应系统可实现数千次高度均匀的 PCR 反应。MNP 分析可从 5 到 2000 个扩增子中鉴定出 5 到 10,000 个标记，大大降低了单个标记的分析成本（Xu 等，2020 年）。这种高度复用的 PCR 提高了标记检测的效率，降低了检测成本。目前，MNP 技术已被开发并应用于多种作物，如玉米（Guo 等，2019 年）、西兰花（Shen 等，2021 年）和黄瓜（Zhang 等，2020 年）。此外，利用 179 个 MNP 作为通用标记，构建了一个 MNP 鉴定系统，用于鉴定金针菇品种，并建立了 232 个栽培和野生菌株的邻接系统发育树（Liu 等，2023 年）。此外，MNP 技术不仅可用于品种鉴定，还可广泛应用于多年生作物育种项目，以加速品种开发（Yang 等，2016 年）。
尽管 MNP 的适用性取得了进展，但尚未有关于葡萄的研究报道。本研究基于31个代表性品种的全基因组重测序数据，开发了一套葡萄通用MNP标记，构建了主要葡萄品种的MNP指纹图谱，为鉴定葡萄品种提供技术支持。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料
试验材料于 2022 年 6 月采集于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树良种郑州葡萄园。为进行 MNP 标记初筛，采用了 31 个不同品种、不同倍性、不同用途的代表性葡萄栽培品种（补充表 1；代码 1-31）。
2.2.DNA提取和全基因组测序
使用CTAB法从新鲜葡萄叶中提取基因组DNA（Doyle，1987）。使用纳米液滴对提取的DNA进行定量，并使用1.0%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。使用NexteraXT试剂（Illumina）制备全基因组测序文库。然后使用Novogene的Illumina Novoseq平台按照制造商的说明对DNA样品进行测序。
2.3.测序数据的处理
Soapnuke软件用于去除具有测序接头、低质量和N碱基比率>1%的读数；获得了高质量的干净数据，用于后续的比对分析（Chen等人，2018）。短序列比对软件BWA（0.7.15）的“mem”算法和比对参数“-t5-k 30-M-R”用于将过滤的干净数据与葡萄参考基因组进行比对（GCA_000003745.2_12X；Li和Durbin，2010）。生成比较结果文件（BAM文件），然后使用Picard（1.54）软件的SortSam.jar工具将BAM文件转换为sortbam文件（Danecek等人，2021）。通过SAMtools软件将比较结果转换为SAM格式。Picard（1.54）软件的MergeSamFiles.jar工具用于合并同一样本的不同库/通道的比较文件。使用Picard（1.54）软件的MarkDuplicates.jar工具标记文库制备过程中PCR扩增产生的重复品。随后，使用GATK（3.7）软件的RealignerTargetCreator和IndelRealigner工具（De Summa等人，2017）对Indel附近的序列进行重新比较和校正，以提高Indel周围SNP基因座的准确性。对处理后的BAM文件进一步进行突变检测。
2.4.葡萄球菌MNP标记物的筛选和引物设计
基于前期收集的SNP信息（Wang et al.，2022），在全基因组中筛选MNP标记位点。首先，使用Bowite 2，使用默认比较参数，将31个代表性葡萄菌株的全基因组数据与葡萄的参考基因组进行比较：GCA_00000374.5.2_12X_genomic.fna.gz。之后，使用SAMtools对结果进行排序，并以BAM格式保存——“-@6-m 2G”参数用于设置六个线程进行排序，以及2GB的内存。使用带有默认参数的samtools-mpile软件来识别所有SNP位点。随后，使用滑动窗口法在整个基因组中搜索候选标记位点——选择125bp的基因组区域，对该区域中的SNPs进行计数，并使用以下方程确定该区域中31个葡萄的判别力（DP）；
DP = n/N
其中，"n "是成对比较所有材料时可区分的样本对数，"N "是比较的样本对总数。
如果该区域包含 3 个以上 SNP 位点，且区分度大于 0.2，则该区域被视为候选 MNP 标记位点。然后，向前滑动 20 bp，重新计算上述指标。对得到的所有候选 MNP 标记位点进行物种特异性检验，保留物种特异性最好的位点作为最终的葡萄 MNP 标记位点。
2.5. 统计数据分析
2.5.1. MNP 遗传多样性分析 根据 MNP 基因型数据计算各种遗传多样性参数，如
MNP 基因型数据计算出各种遗传多样性参数，如小等位基因频率 (MAF)、观察到的杂合度 (Ho) 和多态信息含量 (PIC)。所有这些计算均在 Excel 2016 中使用以下公式进行：
其中，Pi 和 Pj 分别为第 i 和第 j 个等位基因的群体频率。
基因型之间的遗传距离用 TASSEL 5.0（Bradbury et al, 2007）中基因型的平均核苷酸差值来评估。
2.5.2. 全基因组重测序数据分析方法
根据全基因组重测序数据，将获得的数据与参考基因组进行比较。使用 RectChr 软件将获得的 vcf 文件与测序样本进行比较，分析 31 个代表性登录样本之间的遗传差异。使用 vcftools-vcf 命令对 vcf 文件进行合并和过滤，以便进行后续分析。使用 gcta_1.93.2beta 软件（Yang et al, 2011）进行主成分分析（PCA）。结构分析使用 admixture_linux-1.3.0 软件（Alexander 等，2009 年）进行。系统发生树使用 FastTree（2.1.11，-gtr）软件进行分析。为了实现循环可视化，使用了 R 软件（R 版本 4.1.1）中的 "circlize "软件包（circlize 版本 0.4.15）。根据重测序数据以及样本倍性和物种，使用 PowerMarker V3.25 和 Figtree v1.4.4 软件绘制了 31 个代表性葡萄品种的聚类图。
3. 结果
3.1. 582 个 MNP 标记的遗传信息
选择 MNP 位点的目的是实现每个位点的高变异性，以便从每个 MNP 扩增出多个 SNP。所设计的 MNP 面板中实际可实现的 MNP 数量取决于测序深度，该深度可覆盖一定数量的设计 MNP（Guo 等，2021 年）。本研究利用 MNP 技术对 31 个葡萄品种进行了基因分型，共成功分型 582 个 MNP 标记，包括 6078 bp 突变位点（图 1A）。分析表明，葡萄是杂合性很高的品种，夏黑及其早芽突变品种的遗传背景相似。筛选出的 582 个 MNP 标记覆盖了整个基因组，发现它们均匀地分布在 19 条染色体上（图 1B；补充表 2）。每个 MNP 标记包含 2-10 个 SNP 位点。
每个 MNP 标记的等位基因数从 1 到 20 不等。在 582 个 MNP 标记中，494 个标记的区分度超过 80%。此外，利用这 582 个 MNP 标记对同一品种的不同分生株上提取的 31 个代表性品种进行 DNA 扩增，结果一致，表明所鉴定的 MNP 标记具有较高的重复性和稳定性。
