简介
单细胞测序技术是近十年最伟大的科学进展之一，其涵盖多方面的内容。scRNA-seq想必大家都较为熟悉，但是scATAC-seq出现在大家印象中的次数并不多，但是这种现象并不是否定了scATAC的重要性，而是有几个原因造成：1.相较于转录组测序，scATAC测序难度较高，在没有多年积累的高水准实验室之外是很难完成的，很多一般的测序公司也很少开展这种项目；2.很多课题开展都是研究某一种细胞的功能，这样bulk ATAC就能完成，没有必要测scATAC。但是同scRNAseq一样，高质量的scATAC数据，可以帮助我们鉴定特殊细胞亚群的调控机制，其价值也是十分重要的。今天Immugent就来和大家聊一下scATAC数据分析的工具，同出自Satija实验室Seurat的姊妹包--Signac.
Signac被开发出来已经有段时日了，网上也有很多教程。小编之所以重新拾起来说一下是因为对应的文章在上个月发表在了nature methods（IF:28.55）杂志上，这篇文章系统的总结了这个包的功能，而且配套的教程也更新了，之前的很多函数都不能使用了，所以Immugent决定来一波update。
下面小编以这篇文章为主要内容来解读一下Signac包的功能。
主要功能介绍
在Signac之前已经有很多各式各样分析scATAC的软件了，下图列举了它们之间功能的对比情况。其中功能最强大的一个软件是ArchR,但是这个包特别难安装，而且因为版本的问题，无法在4.1版本的R上使用。这个包虽然功能较为齐全，但使用起来非常笨重，小编之前研究了很久这个包，最后决定还是放弃了。
Signac包的流程相对简洁，和Seurat包类似，是由相应的函数构成。在处理数据中最大的区别是seurat读入的是基因表达计数矩阵；而Signac读入矩阵中的每一行代表一个基因组区域（“peak region”）而不是基因，其表示开放的染色质区域，矩阵中的每个值代表在每个峰内映射的每个条形码（即细胞）的Tn5切割位点的数量。
Signac能够端到端分析scATAC数据，包括peak calling, quantification, quality control, dimension reduction, clustering, integration with single-cell gene expression datasets, DNA motif analysis and interactive visualization，基本上就是bulk ATAC能做的分析Signac都可以做。
简要流程
文章中示例数据是来自10x的PBMC样本，和转录组流程一样，scATAC数据处理的第一步也是需要质控：主要根据DNA accessibility assay和TSS enrichment score；接下来就是使用Seurat包进行标准化处理和SCT转换，分细胞亚群；到这里流程就遇到了一个瓶颈问题，和scRNAseq类似，scATAC测序深度也不足，这样对基因的检测能力不强。因此，对scATAC数据的细胞亚群注释多依赖于和scRNAseq结合来鉴定，而且一般都是scRNA和scATAC同时进行才更有意义。
但是值得一提的是10x官方在今年年初就已经推测了多种组合的单细胞多模态试剂盒，理论上我们已经可以同时测一个细胞的转录组和ATAC了；此外，还可以对同一细胞表面蛋白进行定量，如果联合膜蛋白的信息和ATAC将会更准确的对细胞亚群进行定义。
Signac可以和MACS2做到无缝衔接，后者是如今peak calling最常用的软件。进一步对找出的peak进行差异分析可以找到在细胞亚群见哪些基因的开发程度存在差异，联合转录组的信息将会更准确的找到具有潜在重要调节功能的基因，如MS4A1在B细胞群中的开放程度较高；
对细胞因子，还可以进行footprinting分析。转录因子结合到开放染色质导致 Tn5 无法剪切该区域，会在覆盖度高的开放区域（Peak）中出现小范围的覆盖度下降，因此这个下降的小区域称为 TF footprint；通过这种分析我们可以得知在某些细胞亚群中发挥功能的细胞因子。
Signac主要的功能就介绍到这，具体的流程介绍可以去官网(https://satijalab.org/signac/articles/overview.html)查看，下面给出Signac包的安装代码，小伙伴们赶紧操练起来吧！
Signac requires that Bioconductor is installed:
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install()setRepositories(ind=1:2)
To install the latest release of Signac from CRAN:
install.packages("Signac")
To release the latest develop version from GitHub
if (!requireNamespace("remotes", quietly = TRUE))
install.packages("remotes")remotes::install_github("timoast/signac", ref = "develop")
抛出疑问
本来小编是想着先解读这篇文章写一个功能介绍的推文，后面再出一系列实操教程，但是现实是残酷的，小编在跑Signac流程中遇到了很多问题。与scRNAseq数据处理不同，scATAC对基因组注释的版本要求很高，很容易出现各种基因组注释问题，欢迎有相关经验或者有scATAC数据分析的小伙伴通过私信联系小编哦。
