high-throughput seq analysis急先锋——STAR的使用介绍
在所有物是人非的景色里，我最中意你。
正体
这次给大家带来的是ENCODE project的御用比对软件STAR，ENCODE项目是一个由美国国家人类基因组研究所(NHGRI)在2003年9月发起的一项公共联合研究项目，旨在找出人类基因组中所有功能组件[。这是既完成人类基因组计划后国家人类基因组研究所开始的最重要的项目之一。所有在该项目中产生的数据都会被迅速的在公共数据库中公开。
在我之前的那篇RNA-seq数据分析---方法学文章的实战练习文章里关于比对软件的比较中STAR也展现了不俗的表现。所以在处理比对时我也考虑了将HISAT2与STAR共同使用，查看它们的表现情况，选取适合的比对工具。
STAR的安装
cd biosoft && mkdir STAR && cd STAR
wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.5.3a.tar.gz
tar -xzf 2.5.3a.tar.gz
cd STAR-2.5.3a
# for easy use, add bin/ to your PATH
下载需要参考基因组并进行index构建
# downloading dna index fasta file
nohup wget -r -np -nH -nd -R index.html -L ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-90/fasta/homo_sapiens/dna_index/ &
# download gft annotation file
nohup wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-90/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.90.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz &
mkdir STAR_index && cd STAR_index
STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir ~/reference/STAR_index/ --genomeFastaFiles ~/reference/genome/hg38/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa --sjdbGTFfile ~/reference/genome/hg38/Homo_sapiens.GRCh38.90.chr_patch_hapl_scaff.gtf --sjdbOverhang 199
# --sjdbOverhang 数值为reads长度-1
# Mode 为generate
# --genomeFastaFiles --sjdbGTFfile 分别对应fasta文件和GTF文件
STAR的使用
# STAR的manual里面给了最基本的比对参数示例
STAR
--runThreadN NumberOfThreads
--genomeDir /path/to/genomeDir
--readFilesIn /path/to/read1 [/path/to/read2 ]
# 基本示例，针对fastq.gz文件增加--readFilesCommand gunzip -c 参数/--readFilesCommand zcat参数，针对bzip2文件使用--readFilesCommand bunzip2 -c参数
STAR --runThreadN 20 --genomeDir ~/reference/STAR_index/ --readFilesCommand zcat --readFilesIn ~/RNA-seq/LiuPing_data/RNA-seq/SC_w2q20m35_N_1.fq.gz ~/RNA-seq/LiuPing_data/RNA-seq/SC_w2q20m35_N_2.fq.gz
# 输出unsorted or sorted bam file
--outSAMtype BAM Unsorted 实际上就是-name 的sort，下游可以直接接HTSeq
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate
--outSAMtype BAM Unsorted SortedByCoordinate 两者都输出
额外参数说明
# 单独指定注释文件，而不用在构建的时候使用
--sjdbGTFfile /path/to/ann.gtf
--sjdbFileChrStartEnd /path/to/sj.tab
# ENCODE参数
# 减少伪junction的几率
--outFilterType BySJout
# 最多允许一个reads被匹配到多少个地方
--outFilterMultimapNmax 20
# 在未有注释的junction区域，最低允许突出多少个bp的单链序列
--alignSJoverhangMin 8
# 在有注释的junction区域，最低允许突出多少个bp的单链序列
--alignSJDBoverhangMin 1
# 过滤掉每个paired read mismatch数目超过N的数据，999代表着忽略这个过滤
--outFilterMismatchNmax 999
# 相对paired read长度可以允许的mismatch数目，如果read长度为100，数值设定为0.04，则会过滤掉100*2*0.04=8个以上的数据
--outFilterMismatchNoverReadLmax 0.04
# 最小的intro长度
--alignIntronMin 20
# 最大的intro长度
--alignIntronMax 1000000
# maximum genomic distance between mates，翻译不出来，自行理解
--alignMatesGapMax 1000000
STAR的输出
STAR可以根据你的参数设定输出多个结果文件，包含各种信息，下面对默认参数情况下的输出文件做了一个详细的展示，有些不好翻译的地方我选择使用原汁原味的manual text
- Aligned.out.sam
Aligned.out.sam当然就是我们的比对结果啦！
E00516:168:H37WKCCXY:8:1101:6400:59130 99 1 92836373 255 20M1063N129M = 92837548 4244 GGCTTGTCTATCCCTCACAGTACCAAACGATTCCCTGGTTATGATTCTGAAAGCAAGGAATTTAATGCAGAAGTACATCGGAAGCACATCATGGGCCAGAATGTTGCAGATTACATGCGCTACTTAATGGAAGAAGATGAAGATGCTTA AAFFFJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ NH:i:1 HI:i:1 AS:i:289 nM:i:0
# 我截取了一条比对信息
我们来看一下最后面的 NH:i:1 HI:i:1 AS:i:289 nM:i:0
NH:i:后面的数值代表着此条read比对到几个loci，1代表着unique map，数值大于1代表着multi-mappers
HI:i:后面的数值attrbiutes enumerates multiple
alignments of a read starting with 1，下游分析接cufflinks or stringtie的时候需要使用参数--outSAMattrIHstart 0
AS:i:的数值代表着local alignment score (paired for paired-edn reads)
nM:i:的数值代表着the number of mismatches per (paired) alignment, not to be confused with NM, which is the number of mismatches in each mate
关于下游处理工具的兼容性还需要使用者自己仔细参考manual
- Log.out文件
Log.out文件记录了程序运行时的信息，可以用来回溯错误信息。
tail Log.out
Joined thread # 12
Completed: thread #13
Joined thread # 13
Joined thread # 14
Joined thread # 15
Joined thread # 16
Joined thread # 17
Joined thread # 18
Joined thread # 19
ALL DONE!
- Log.progress.out文件
Log.progress.out报告比对进程情况，1分钟记录一次
tail Log.progress.out
Sep 08 17:57:52 33.1 23115987 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:58:53 34.0 24349711 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:00:23 33.5 24789186 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:01:51 33.3 25493588 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:02:58 33.5 26284824 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:04:23 33.7 27163519 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:05:36 33.1 27428080 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:06:54 33.8 28659661 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:08:00 34.3 29741743 285 94.1% 283.9 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
ALL DONE!
- Log.final.out文件
Log.final.out包含了比对结束后比对统计的信息
head Log.progress.out
Time Speed Read Read Mapped Mapped Mapped Mapped Unmapped Unmapped Unmapped Unmapped
M/hr number length unique length MMrate multi multi+ MM short other
Sep 08 17:17:47 2.9 88583 288 94.2% 287.4 0.1% 4.0% 0.1% 0.0% 1.7% 0.0%
Sep 08 17:18:53 14.5 711158 282 94.1% 281.9 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:20:06 19.2 1329197 284 94.1% 283.8 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:21:19 32.7 2923414 284 94.1% 283.7 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:22:39 32.5 3629649 285 94.1% 283.9 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:23:49 32.4 4248206 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:24:57 36.6 5483555 285 94.1% 284.3 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:26:03 35.7 6012744 285 94.1% 284.4 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
tail Log.progress.out
Sep 08 17:57:52 33.1 23115987 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 17:58:53 34.0 24349711 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:00:23 33.5 24789186 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:01:51 33.3 25493588 285 94.1% 284.0 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:02:58 33.5 26284824 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:04:23 33.7 27163519 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:05:36 33.1 27428080 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:06:54 33.8 28659661 285 94.1% 284.1 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
Sep 08 18:08:00 34.3 29741743 285 94.1% 283.9 0.2% 4.0% 0.1% 0.0% 1.8% 0.0%
ALL DONE!
- SJ.out.tab文件
SJ.out.tab包含了剪切信息，其实目前我还没怎么看懂，等以后再来补坑。
head SJ.out.tab
1 14830 14969 2 2 0 1 9 69
1 14844 14969 2 2 0 0 2 30
1 15039 15795 2 2 1 2 7 53
1 15948 16606 2 2 1 1 1 41
1 16028 16606 2 2 0 0 1 57
1 16311 16606 2 2 0 2 0 67
1 16766 16853 2 2 0 2 0 43
1 16766 16857 2 2 1 17 108 73
1 16766 16875 2 2 0 0 1 61
1 16789 16875 2 2 0 0 1 53
# 参数释义
column 1: chromosome
column 2: first base of the intron (1-based)
column 3: last base of the intron (1-based)
column 4: strand (0: undened, 1: +, 2: -)
column 5: intron motif: 0: non-canonical; 1: GT/AG, 2: CT/AC, 3: GC/AG, 4: CT/GC, 5:AT/AC, 6: GT/AT
column 6: 0: unannotated, 1: annotated (only if splice junctions database is used)
column 7: number of uniquely mapping reads crossing the junction
column 8: number of multi-mapping reads crossing the junction
column 9: maximum spliced alignment overhang
写在最后
其实我探究STAR的最终目的实现利用STAR的Chimeric and circular alignments. 我自己处理的数据里面存在着fusion-protein，而其余的比对软件暂时还没发现有这个功能的
当使用--chimSegmentMin参数的时候，STAR可以把read拆分为两部分，分别进行比对
STAR-Fusion是一个package，可以承接STAR的chimeric output，点我看代码
当然STAR还可以做2-pass mapping，可以detect more splicesreads mapping to novel junctions
使用--quantMode GeneCounts参数还可以达到HTSeq的效果哦，可以帮你生成count matrix，省去你HTSeq的功夫， 有空回来做一个比对，看HTSeq和GeneCounts的效率。
参考文献：
https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf
日常Bob镇楼
以下为高通量测序数据处理系列快速通道：
高通量测序数据处理学习记录（零）：NGS分析如何选择合适的参考基因组和注释文件
高通量测序数据处理学习记录（二）：Read Counts的提取
高通量测序数据处理学习记录（三）：Pathway Analysis及GSEA
高通量测序数据处理学习记录（四）：DeepTools学习笔记
