Nat Methods | 亚细胞分辨率癌细胞代谢研究进展与展望

原创 huacishu 图灵基因 2022-09-03 10:16 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：huacishu

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亮点：

1、作者综述了识别细胞器内代谢途径的方法，包括基于质谱的成像、拉曼光谱和荧光显微镜等，通过新方法分离关键细胞器，并使用定制的同位素追踪策略；

2、作者还研究了这些方法的优势和局限性，并展望了这一研究领域的未来。

美国国立卫生研究院Mioara Larion教授课题组在国际知名期刊Nat Methods在线发表题为“Advances in measuring cancer cell metabolism with subcellular resolution”的论文。表征癌症中的代谢对于理解肿瘤生物学和开发潜在治疗方案至关重要。虽然大多数代谢研究分析所有细胞的平均代谢产物水平，但亚细胞代谢组学可以提供与疾病相关的生化过程的更详细的见解。方法学的局限性阻碍了亚细胞代谢组学在癌症研究中的广泛应用。

然而，最近已经开发出了区分和识别细胞器内代谢途径的方法，包括原位监测代谢的最新方法（如基于质谱的成像、拉曼光谱和荧光显微镜），通过新方法分离关键细胞器，并使用定制的同位素追踪策略。作者研究了这些方法的优势和局限性，并展望了这一研究领域的未来。

整个细胞代谢组在发生代谢途径的亚细胞细胞器中高度分隔（空间代谢组学）。空间限制使细胞能够优化某些酶途径。此外，酶受益于特定条件，如碱性pH或酸性pH。这些分区代谢过程影响许多细胞和组织功能；因此，有必要了解生物化学网络如何跨亚细胞结构发挥作用，以确定代谢如何对健康和疾病（包括癌症）中的可观察分子表型发生影响。

癌细胞的一个特征是它们能够重新调整新陈代谢，以支持不受控制的细胞生长和增殖。肿瘤细胞可以上调大分子的循环，从而激活自噬和随后的溶酶体蛋白水解，从而提供必需氨基酸的来源。此外，高尔基体（GA）和内质网（ER）在脂质代谢中发挥中心作用，并经历与营养缺乏（ER）或活性氧（ROS）增加相关的应激，这可能导致细胞凋亡。这些局部代谢过程可以用作癌症治疗的潜在靶点。

虽然已经认识到研究特异性代谢的重要性，但基于质谱（MS）的代谢组学的研究侧重于数百万细胞的平均代谢，而不能在亚细胞水平上表征代谢。我们无法清楚地观察发生在一个以上亚细胞位置的相同代谢反应，这是理解细胞代谢及其疾病状态变化的主要障碍。

为此，空间代谢组学可以检测由疾病或治疗引起的亚细胞异常。历史上，已经实施了不同的方法来解决这个主要问题，例如通过离心分离细胞器或使用非离子洗涤剂（图1a）。还通过使用与针对特定细胞器蛋白的抗体结合的磁珠来分离细胞器（图1b）。分离细胞器后，可以进行代谢组学分析。

同位素追踪方法可以通过将特定代谢物的产生分配给局部途径来解开代谢分区（图1c）。或者，可以使用最先进的技术直接观察细胞器代谢，包括拉曼光谱（图1d）、质谱（图1e）和荧光显微镜（图1f，g）。本文作者回顾了用于研究代谢途径分区的技术进展及其在癌症研究中的潜在应用。这些方法提高了我们对癌细胞代谢重编程的理解，但它们也可以应用于代谢改变的其他疾病。作者强调了技术前沿的主要进展和阻碍我们充分揭示疾病细胞的细胞器特异性代谢重编程的障碍。

评估提取的细胞器的代谢

细胞器是通过差速离心技术提取的，该方法通过以相对较低的速度（~600g）来分离最大的细胞器，如细胞核，而较小的细胞成分，如核糖体，则以高速（~300000g）分离（图2a）。这种传统方法的缺点是细胞器分离需要很长时间，并产生不纯的亚细胞组分。虽然可以重复该过程以重新分离特定的细胞器，但在长时间的制备过程中，代谢物可能泄漏到提取缓冲液中。此外，即使在较低的温度下，酶活性仍会发生，导致代谢物库的变化，从而妨碍对代谢的准确研究。

为了进一步分离沉降速度相似的细胞器，可以使用密度梯度离心法（图2b）。但是，为产生梯度而添加的溶质严重干扰了代谢组学研究中常规进行的基于下游液相色谱（LC）-质谱的代谢物分析。

为了解决溶质的存在问题，基于免疫沉淀的方法最近已用于分离细胞器，如线粒体、过氧化物酶体和溶酶体（图2c，d）。已经开发了与针对驻留在溶酶体（LAMP1）、过氧化物酶体（PEX3）或线粒体（OMP25和TOM20）中的内源性蛋白的抗体结合的磁珠。通过使用基因编码标签加速样品制备将分离时间从数小时缩短到数分钟，并提高了纯度。下面，描述了在癌症代谢领域每个细胞器的实例：

溶酶体

溶酶体是参与分子降解和运输的细胞器。它们的酸性内部环境对于其中所含的许多水解酶的活性是必需的。不同的过程涉及复杂生物分子的吞噬，细胞或部分细胞终止于溶酶体内，其中大分子被分解。然后，生成的代谢物可以被回收并纳入代谢途径，在营养素可用性差或细胞快速增殖需求高的情况下，作为额外的营养素来源。因此，溶酶体是依赖大分子水解作为营养来源的肿瘤的一个有吸引力的靶点。

过氧化物酶体

过氧化物酶体被认为是清除线粒体产生的活性氧的细胞器，它参与了长链二羧酸和支链脂肪酸的降解；磷脂、胆汁酸、二十二碳六烯酸和多不饱和脂肪酸的生物合成。癌细胞中增殖物激活受体-α（PPAR-α）信号的增加导致活性氧升高，从而损伤DNA，并可能导致内质网应激和炎症。此外，过氧化物酶体参与介导对组蛋白去乙酰化酶抑制剂vorinostat的耐药性，其作用机制是促进ROS介导的淋巴瘤细胞凋亡。因此，该细胞器在与癌症和耐药性相关的代谢重编程中起关键作用。

线粒体

线粒体是癌症中研究最多的细胞器，因为它们在ATP合成、脂肪酸β-氧化、三羧酸（TCA）循环、氧化还原稳态和呼吸链中起作用。线粒体还含有编码与不同恶性肿瘤相关的酶的基因。分离线粒体的方法很费力；它们需要数小时，并利用蔗糖梯度超速离心，随后释放与LC-MS不相容的化合物。

内质网

内质网是细胞内脂质合成的主要场所之一，其参与蛋白质合成、折叠、Ca2+信号传导和翻译后修饰受到了广泛关注。虽然目前的分离方法使相对纯度较高，但必须评估细胞器的完整性，因为分离过程涉及几个步骤和可能会对内质网造成破坏的离心过程。因此，可以通过测量细胞色素C还原酶（一种内质网驻留膜蛋白）的酶活性来测定提取部分的产率和完整性。

高尔基体

高尔基体在蛋白质分类、修饰和传递中起着关键作用。有证据表明脂质代谢、膜转运和高尔基体形态和动力学之间存在密切联系。磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）是在高尔基体膜上募集蛋白质的一种中枢脂质信号，这些蛋白质对于运输载体的形成至关重要。在癌症中，PI4K被显示为上调并与PI3K mTOR激活相关，PI3K是负责细胞生长和增殖的主要信号轴。使用基于荧光的方法对高尔基体中的PI4P水平进行了量化，其水平与乳腺癌的侵袭性相关。

细胞核

由于在细胞核中发现了几种代谢酶，包括ATP柠檬酸裂解酶、乙酰辅酶a合成酶2（ACSS2）和丙酮酸脱氢酶复合物（PDC），细胞核被认为是代谢中枢。发生在细胞核中的生化反应主要涉及调节基因表达的代谢产物的产生，如乙酰辅酶A，它可以为组蛋白乙酰化提供乙酰单元。值得注意的是，在梯度离心分离的细胞核中发现了活性PDC和糖酵解中间体。这一发现提出了一种潜在的癌症代偿机制，在其中PDK（丙酮酸脱氢酶的调节酶）被抑制。

优点和局限性

传统上，不同细胞器的分离是通过使用差速离心和多步梯度超速离心方法的亚细胞分馏完成的，这对于下游代谢组学研究并不理想。这些方法的一个主要限制是具有相似沉降速度的细胞器的交叉污染。此外，传统的亚细胞分馏方法需要数小时，这可能导致细胞器组成的变化，特别是对于不稳定的小分子。传统方法的另一个缺点是材料产率低。

为了减少提取溶剂中代谢物的泄漏并减少细胞器完整性的损失，最近引入了依赖免疫沉淀的快速方法。尽管这些基于免疫沉淀的策略比传统的基于离心的方法更准确，但仍存在许多问题。首先，需要优化代谢物的标准化，使其既独立于标记物的表达，又与细胞器的总含量相关。然后，需要改进磁珠制备，以减少批量效应带来的误差。此外，每次需要添加对照免疫沉淀程序，以评估背景材料与珠子的结合。最后，基因构建体的缺乏可能会阻碍其普遍使用。

代谢分区的同位素示踪

同位素示踪用于跟踪代谢物中特定原子的代谢。事实上，同位素追踪已被用于描述健康和疾病中代谢途径的划分。同位素示踪实验结合遗传方法可以用来探索特定细胞器的代谢。尽管13C示踪方法已广泛用于探索几种代谢物的代谢情况，但某些酶不允许通过反应追踪13C标记的碳。

此外，作为某些肿瘤相关表型的关键成分的同工酶，如胶质瘤中的突变体IDH1/2，表现出相同的碳转化，产生NADH或NADPH。为了克服这一限制，采用了2H追踪方法来评估NADPH和NADH产生的分区。Lewis描述了一种基于IDH1和两种突变酶的异位表达的系统，以评估NADPH产生的分区（图3b）。除了需要将质子从NADPH转移到2HG之外，这些蛋白质还具有在胞质溶胶（IDH1）或线粒体（IDH2）中将α-KG转化为2HG的新形态活性。

鉴于[3-2H]和[1-2H]葡萄糖的标记，戊糖磷酸途径（PPP）对NADP的贡献为（~50%），并且当G6PD被敲除时，它们消除了大部分标记（图3a）。当细胞接种在含有[4-2H]-葡萄糖的培养基中时，大多数标记通过IDH2活性转移。此外，通过利用[4-2H]-葡萄糖，研究人员可以探索胞浆NADH代谢，因为可以在减少的胞浆脱氢酶产物中检测到标记，其中包括乳酸、甘油-3-磷酸和苹果酸。

采用A549细胞，并通过用洋地黄素选择性渗透质膜来洗涤细胞溶质含量。随后，在含有不同同位素示踪物的培养基中孵育“细胞重影”（具有渗透性质膜和被洗掉的细胞溶质含量的细胞）（图3c）。在定义供给TCA的不同酶如丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶之后，使用[U-13C]-丙酮酸盐和[U-13C]-谷氨酰胺以及气相色谱-质谱分析来确定线粒体对不同药物或通过用靶向丙酮酸羧化酶的siRNA转染细胞诱导的代谢扰动的反应。该工作为研究线粒体代谢提供了一种替代方案，同时将线粒体维持在其细胞微环境中。

由于某些酶反应是细胞器特异性的，如溶酶体中的蛋白质水解，因此使用标记蛋白质补充剂的同位素追踪方法可用于推断溶酶体蛋白质水解的活性以及由此产生的氨基酸的利用。例如，利用13C标记的酵母蛋白追踪致癌Ras转化细胞中蛋白质衍生氨基酸的命运（图3d）。

原位亚细胞代谢测定

由于缺乏在合成位点识别和量化代谢物的技术，亚细胞代谢一直难以研究。因为没有生物方法来扩增代谢物，如转录组，所以信号灵敏度方面的技术进步至关重要。亚细胞代谢研究的第二个主要限制是空间分辨率的限制：哺乳动物细胞的直径为10-100μm。妨碍使用标准代谢组学方法的第三个限制是，无法在没有事先分离的情况下从复杂混合物中识别代谢物。过去几年在这些方面取得了进展，特别是在成像方面，如下所述：

基于质谱的成像

基于质谱的成像（MSI）是最有前景的成像的技术之一，可以提供广泛的代谢物覆盖范围、更高的检测灵敏度、空间分辨率和详细的亚细胞代谢评估所需的高通量。基于检测技术有不同的方法，包括基质辅助激光解吸/电离（MALDI）、电喷雾解吸电离（DESI）和二次离子质谱（SIMS）（图4a）。

MALDI-MS通过使用脉冲激光获取质谱阵列并绘制不同质荷比下这些离子的强度，提供代谢物的空间可视化。该技术已广泛用于单细胞分析，但其用于亚细胞代谢组学的频率较低（图4b）。该方法可适用于癌症生物学，特别是以高通量方式检测和定量脂质种类。

空间分辨率可以通过减小离子源“探针”的尺寸来提高，如SIMS中所示，这可以实现纳米尺寸的空间分辨率（图4a，c）。这种模拟离子质谱的优点包括更好的空间分辨率和检测细胞表面非极性物质（如磷脂）的能力。尽管该仪器可以在亚细胞分辨率的单个测量中捕获数百种非极性化合物，但其缺点是分析前必须对样品进行冷冻干燥。

与使用真空进行样品电离的MALDI和SIMS不同，ESI-MS在环境压力下电离样品，从而能够对活细胞的细胞内容物进行采样。结合显微镜观察细胞器，这种方法有望用于活细胞的亚细胞代谢分析（图4d）。

拉曼和红外成像显微镜

红外光谱和拉曼光谱的主要限制是复杂生物样品的广泛信号重叠。通过集成生物分子成分分析（BCA）算法和细胞器荧光标记，自发拉曼显微镜现在可以表征和量化总蛋白质、脂质、核酸和糖的浓度。此外，关于脂质结构的详细信息的直接定量，使研究人员能够确定活细胞细胞器中的脂质代谢（图5a）。最近应用该方法来考察活细胞中的单细胞器代谢，并且能够量化和鉴定IDH1mut胶质瘤细胞中基于脂质的脆弱性（图5b）。这种方法的发展解决了在单个细胞器水平上确定活细胞中的特异性代谢的局限性。

为了克服自发拉曼显微镜中的低信号，开发了受激拉曼光谱（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。CARS已用于对细胞中的脂质、蛋白质、脂滴和脂肪储存进行成像（图5c）。通过引入SRS，解决了CARS显微镜的一些局限性，例如信号与分析物浓度和高背景信号的非线性依赖性。2019年推出了一种商用仪器，它将荧光光谱与拉曼光谱结合起来（图5d）。该多路复用系统在同一显微镜中包含荧光能力、CARS和SRS。

荧光显微镜

双光子荧光和FLIM在代谢研究中的应用之一是NADH、NADPH和FADH2的成像。由于许多代谢酶依赖于NADH和NADPH以及FADH2作为还原剂的存在，了解亚细胞水平上这些辅助因子的确切数量对于理解癌症代谢非常重要。测量NADPH的不同策略是通过使用遗传编码的荧光蛋白（图6a）。该蛋白特异性结合胞浆中的NADPH，并在细胞中增强NADPH的荧光达10倍。

线粒体特异性荧光探针

大多数线粒体识别探针依赖于膜本身的负电位，并被设计为阳离子。例如，Mito Rh用于测量线粒体中的ATP特异性（图6b）。另一个例子是二氢乙胺（DHE）与线粒体识别部分的组合。该探针专门设计用于测量线粒体活性氧，该活性氧在癌症生物学中普遍存在，否则难以测量（图6c）。此外，针对ROS、NADH、ATP、H2O2和其他代谢物，已经开发了靶向线粒体的遗传编码荧光蛋白，其与代谢物敏感荧光蛋白序列融合。

内质网特异性荧光探针

用于检测和定位ER中活性氧的最常见的小分子荧光探针之一是对甲苯磺酰胺。此外，内质网定位序列，如KDEL和钙网蛋白信号序列，已与基因编码的荧光探针融合，以测量代谢产物，如ATP。

高尔基特异性荧光探针

与线粒体或内质网探针相比，开发的GA特异性荧光探针更少。Zhang等人设计了一种用于测量半胱氨酸水平的探针，具有硫苯甲酸部分的高尔基体靶向基团，其与半胱氨酸自身反应并增强分子的荧光（图6d）。该探针用于测量半胱氨酸水平的增加作为对ROS诱导的高尔基体应激的反应。

溶酶体特异性荧光探针

用于对溶酶体ATP、NO、HNO H2O2、HOCl或Ca2+成像的探针被设计为包含在溶酶体中积累的亲脂性胺或与溶酶体定位序列融合的遗传编码荧光探针。Jun等人报道了一种双光子荧光探针，用于对溶酶体ATP（溶酶体-ATP）成像。该探针在454nm处发射蓝色荧光，而在pH~5下添加ATP导致其在557nm处发射强黄色荧光（图6e）。

核特异性荧光探针

至于其他细胞器，特异性靶向细胞核的核定位信号肽与荧光探针融合（图6f）。例如，Wen等人开发了一种与小分子探针结合的肽，用于对核H2O2进行成像。该探针含有到达核的核靶向序列，与H2O2反应后，在核内发出黄色荧光信号（图6f）。

对未来的展望

研究单细胞器代谢的未来还包括结合具有互补优势的不同模式，例如，与MALDI结合的显微镜、与拉曼光谱结合的荧光显微镜、与MALDI结合的扫描电子显微镜和与纳米ESI结合的拉曼显微镜。我们可以进一步将荧光标记的使用与拉曼显微镜的分辨率和活细胞中细胞器的化学图谱的提高相结合，通过荧光成像来可视化细胞器。不同技术的综合优势可以进一步推进亚细胞代谢组学领域。

教授介绍

Larion博士最初在罗马尼亚获得理学学士学位，并在佛罗里达州立大学化学和生物化学系获得理学硕士和博士学位。她在研究生院的工作涉及生物物理学和酶学。在这段时间里，Mioara Larion博士对学习酶的功能以及酶如何导致或加剧某些疾病状态产生了热情。此后不久，她加入了NIH，担任研究员。Mioara Larion博士研究的首要目标和驱动因素是最终观察癌症代谢组学对患者诊断、治疗和生存的直接影响。Larion博士希望她的研究最终能为每位患者创建一张“代谢组图”，概述他们的营养素可用性、突变特征和代谢组学依赖性。

参考文献

Ruiz-Rodado V, Lita A, Larion M. Advances in measuring cancer cell metabolism with subcellular resolution. Nat Methods. 2022;10.1038/s41592-022-01572-6. doi:10.1038/s41592-022-01572-6.