文献
2023
Nature Communications
Epigenetic modifications regulate cultivar-specific root development and metabolic adaptation to nitrogen availability in wheat
课题背景
（1）提高氮利用效率（NUE）已经成为可持续农业的迫切需求。NUE主要由两个组成部分构成：氮吸收效率（NUpE）和氮利用效率（NUtE）。NUpE涉及从土壤中获取氮，而NUtE表示每单位获得的氮所产生的产量。在氮素对冬小麦、大麦等作物的可利用性受限的情况下，研究表明与NUtE相比，NUpE在决定NUE方面更为重要。为了在低氮条件下提高NUE和谷物产量，必须增强氮的吸收，这主要受到硝酸盐转运蛋白的调控。由于外部环境因素的影响，土壤中硝酸盐的浓度可能会出现大幅波动，因此，根系结构在高效吸收硝酸盐方面发挥着至关重要的作用。
（2）KN9204和J411是表现出在低氮条件下具有不同农业性状（如NUE、根系结构和产量等）的小麦栽培品种。利用这些材料，作者成功地鉴定了与NUE相关的若干数量性状位点（QTLs），涵盖了根长、根尖和谷物蛋白含量等因素。作者最近完成了KN9204的参考基因组的组装，并鉴定了882个氮代谢基因。在KN9204和J411之间进行的比较转录组分析显示，在低氮限制条件下，特别是在与产量相关的穗组织和在生殖发育期间的种子中，两者呈现出不同的响应程序。先前的研究强调了根系结构系统（RSA）对NUE的重要性，以及在KN9204和J411之间存在的RSA的显著差异。然而，在KN9204和J411根部不同转录程序的调控机制尚不明确。
（3）表观遗传因子在调控营养吸收、新陈代谢以及植物对营养素可利用性的协同响应中所起的关键作用。例如，SET DOMAIN GROUP 8基因通过在拟南芥中对H3K36me3的调控，以应对氮水平的变化。类似地，HISTONE DEACETYLASE 19基因负责调控根细胞的伸长，并在磷饥饿条件下通过调控磷稳态基因的表达来调节拟南芥中的根部对磷的响应。在水稻中，由NITROGEN-MEDIATED TILLER GROWTH RESPONSE 5招募的PRC2通过在分枝抑制基因上沉积H3K27me3来调控分蘖。此外，在AtNRT2.1位点的H3K27me3水平影响根部对硝酸盐的吸收，这一过程由HIGH NITROGEN INSENSITIVE 9和PRC2介导。尽管在理解拟南芥和水稻等植物中表观遗传在营养吸收和代谢中的作用方面取得了进展，但小麦中这些过程的共同调控及其对营养素可利用性的响应仍然大部分未被探索。
亮点
本研究中，作者使用CUT&TAG技术，对两个小麦品种KN9204和J411在不同氮素条件下的三种不同组织中的各种组蛋白修饰和组蛋白变异进行分析。这份表观遗传图谱为了解在低氮条件下这两个小麦品种的染色质景观提供了全面的认识。KN9204和J411品种之间染色质修饰水平的不同影响了氮代谢的偏倚，并有潜力以品种特异的方式调节基因表达。此外，作者发现通过化学抑制或基因突变来操纵H3K27ac和H3K27me3的表观遗传修饰模式可以显著影响KN9204和J411的低氮适应策略。
结论1 不同氮处理条件下特定组织的染色质图谱
Fig 1a-b
为了研究转录调控及表观调控，作者对小麦品种KN9204和J411在正常氮（NN）和低氮（LN）条件下的根、抽穗叶和种子进行了各种组蛋白修饰的CUT&TAG分析（Fig 1a），与之前生成的转录组数据对应。
Fig S1e
如预期一致，H3K27ac和H3K4me3与高表达基因相关，而H3K27me3富集在低/非表达基因中。H3K4me3和H2A.Z对基因表达水平没有显示偏好（Fig S1e）。超过一半的H3K9me3峰值位于转座元件区域。参与生物和非生物胁迫应答的基因相对于发育和激素相关基因具有更高的H2A.Z水平。
作者使用ChromHMM软件系统地定义了染色质状态（Fig 1b）。15种染色质状态（CS）可以分成五个主要类别，包括启动子（CS1-4）、转录（CS5-8）、增强子（CS9-11）、抑制性（CS12-14）和无信号（CS15），每种状态具有不同的基因组覆盖、TE富集和基因表达水平（Fig 1b）。启动子和增强子状态都与H3K27ac、H3K4me3和H3K27me3相关，但分别位于转录起始位点和基因间区域（Fig 1b）。抑制性状态主要富集于H3K27me3，覆盖了约10%的基因组，而无信号状态占据了基因组的主要部分（约83%）。因此，在各种组蛋白修饰的背景下，基因组的有限部分（约7%）处在转录或参与转录调控中（Fig 1b）。
Fig 1c-f
此外，作者想研究染色质状态改变如何反映小麦品种、组织类型和氮素条件之间的差异。例如，在KN9204中，与硝酸盐在根中的摄取相关的基因（TaNRT2_3A）、在叶中的同化相关的基因（TaNIA_6D）以及在种子中的氨基酸储存相关的基因（TaPROT2_4D）在低氮条件下显示出不同的染色质状态（Fig 1c）。作者发现，增强子（CS9-11）区域是不同品种之间变化最大的染色质区域，而启动子（CS1-4）区域主要受氮素可用性的影响（Fig 1d）。
此外，作者计算了不同组蛋白修饰的变异系数，发现在不同氮素条件和小麦品种之间，H3K27ac和H3K27me3表现出最高的变异系数（Fig 1e）。作者还观察到，远端H3K27ac表现出品种特异性，而启动子H3K27ac表现出更大的组织特异性（Fig 1f）。对于H3K27me3，远端和启动子峰均表现出品种特异性。因此，具有不同染色质状态的基因组区域受到小麦品种、组织类型和氮素条件差异的影响，特别是对于H3K27ac和H3K27me3修饰。
结论2 组蛋白修饰的变异导致了NMG的表达差异
Fig 2a-c
NMG对植物吸收和氮素利用至关重要，它包括编码硝酸盐转运蛋白（NPF、NRT2、NAR2、CLC和SLAH）、硝酸盐还原酶（NIA、NIR）、铵离子转运蛋白以及氨基酸转运蛋白（APC家族成员）的基因，参与编码铵离子同化的酶（GS、GOGAT、GDH、ASN、AspAT）的基因、以及与氮代谢相关的转录因子。此前，作者通过与短柄草、大麦、水稻、高粱、玉米和拟南芥进行序列比对，共鉴定出小麦中的882个NMGs。
作者对KN9204和J411之间的NMGs进行了DNA变异、启动子区域中H3K27ac修饰以及转录水平的比较。结果显示，约有25%的NMGs在KN9204和J411之间表现出差异表达，而只有大约5%的NMGs在调控区域（启动子中的H3K27ac区域）具有DNA序列变异（Fig 2a）。KN9204和J411之间NMGs表达变化存在于不同的组织中的不同基因家族（Fig 2b）。例如，在根部，相对于KN9204，在LN条件下J411中NRT2和NIA的表达水平都较高，而在KN9204中NPF家族基因被激活。此外，在旗叶中，KN9204中NIA基因上调，而J411中没有。然而，在种子中，相对于J411，编码NPF和GS的基因的相对表达在KN9204中更高。
不同栽培品种中NMGs的偏倚表达不太可能受到它们调控区域内DNA序列的变异影响，因为只有16个基因属于这种类型（Fig 2c）。相反，表现出偏倚表达的大多数NMGs都有H3K27ac（66.9%）和H3K27me3（45.6%）的差异峰（Fig 2c）。
Fig 2d-f
在根中，NRT2家族在两个栽培品种中在LN/NN条件下显示出类似的H3K27ac和H3K27me3变化，但在J411中比在KN9204中更为显著（Fig 2d）。例如，在TaNRT2_6A（TraesCS6A02G031000）位点，对LN的响应中，两个栽培品种中都发生了H3K27ac的增加和H3K27me3的减少，但在J411中更为显著（Fig 2e）。这也与在J411中LN条件下TaNRT2_6A的诱导表达水平更高一致（Fig 2e）。参与从根部向茎的硝酸盐转运的TaNPF2.3在KN9204中通过减少H3K27me3而被激活，在J411中伴随着H3K27ac的显著减少（Fig 2d）。一致地，TaNPF2.3_7B在LN/NN条件下在KN9204中增加，而在J411中减少（Fig 2e）。此外，在LN条件下相对于NN条件下，KN9204的茎部硝酸盐含量高于J411（Fig 2f）。总的来说，H3K27ac和H3K27me3的差异与NMGs的表达偏倚相关，导致了KN9204和J411中不同的氮代谢过程。
结论3 品种特异的H3K27ac通过转录调控影响氮利用效率
Fig 3a-c
鉴于H3K27ac在调节LN/NN条件下不同组织和栽培品种中NMGs染色质状态和表达模式的重要性，作者扩展到利用K均值聚类来识别品种特异的H3K27ac区域（Fig 3a）。总体而言，与所有H3K27ac峰相比，品种特异的H3K27ac峰主要在基因远端区域富集，而在启动子和基因区域中缺乏（Fig 3b）。
作者对KN9204中特异性的远端H3K27ac调控基因做了GO功能富集分析，发现主要富集于细胞壁合成、原木质部发育和养分储备等方面。其中，一些已知的用于将养分运输到茎部的基因，如VASCULAR RELATED NAC-DOMAIN PROTEIN 7 (TaVND7) ，XYLOGLUCAN ENDO-TRANSGLUCOSYLASE/HYDROLASE25(TaXTH25) 。在J411特异的远端H3K27ac的靶基因中没有富集任何显著的GO term（Fig 3c）。
Fig 3d-e
此外，作者研究了品种特异的远端H3K27ac区域对KN9204-J411种群的QTL内的差异表达基因的影响。与启动子区域内的DNA序列变异相比，品种特异的远端H3K27ac区域与与氮吸收（Nup）、氮浓度（Nct）、最大根长（MRL）和谷物蛋白质含量（GPC）等性状相关的QTL区域内的DEGs表现出更为强大的相关性。由KN9204特异的H3K27ac峰主导的靶基因在与NUE相关的性状主导的QTL中显著富集，这些优质基因决定因子来自KN9204（图3d）。相反，受J411特异H3K27ac区域影响的基因在与叶片大小相关的QTL中富集（Fig 3d）。例如，在众所周知的qMRL-7B位点内，总共鉴定出69个DEGs，其中仅有九个基因在其启动子区域存在DNA序列变异。相反，有34个基因存在品种特异的远端H3K27ac peak。
作者观察到TraesCS7B02G317800和TraesCS7B02G326900两个已知的根发育调节因子在KN9204中表现出显著升高的表达水平。这种表达上调与KN9204特异的H3K27ac远端调控区域的存在相关（Fig 3e）。
Fig 3f
此外，作者还通过荧光素酶报告基因实验，确定了这些品种特异性的调控区域的功能潜力（Fig 3f）。然而，由于小麦中精确的3D基因组数据有限，充分理解这些远端区域的调控功能存在很大挑战。
结论4 LN诱导的H3K27ac变化影响了KN9204和J411中差异适应性
Fig 4a
作者进一步研究了LN诱导的H3K27ac动态在导致KN9204和J411之间差异适应性中的作用。在LN/NN条件下，KN9204和J411在不同组织中显示出不同的H3K27ac动态模式。在根部，KN9204的H3K27ac水平变化较为微弱，但在旗叶和种子中变化更为显著。而J411在根部表现出明显的降低和相对较低的增加，而在地上组织中变化较小。作者发现H3K27ac的动态变化导致了KN9204和J411在根部对LN产生不同的响应（Fig 4a）。在J411中，近端区域（启动子和基因区域）中H3K27ac的丧失导致了在LN/NN条件下，功能富集于生长素稳态、细胞分裂素代谢和激素信号的基因下调（Fig 4a）。H3K27ac的增加与激活负责硝酸盐吸收、转运和同化的基因有关，包括TaNRT2和TaNIA（Fig 4a）。相反，在KN9204的根部，H3K27ac的增加激活了参与细胞分裂素生物合成、生长素极性转运、碳水化合物和有机阳离子的转运蛋白的基因，如DWARF27（TaD27）、PIN-LIKES 7（TaPILS7）和LONELY GUY 4（TaLOG4）（Fig 4a），这些基因在LN条件下促进了根的生长。
Fig 4b-c
在KN9204中H3K27ac的丧失导致了参与磷酸离子运输的基因的下调。一致地，与KN9204相比，J411的根系对LN的响应较低，表现为LN条件下根尖更多、根直径更大（Fig 4b，c）。这最终导致了KN9204的根表面积增加和总根体积更大。因此，对LN的动态H3K27ac变化在KN9204中更倾向于增强根的生长，而在J411的根中则更加强了氮吸收系统。在KN9204的旗叶中，与蔗糖代谢和木质部发育相关的基因中发现了H3K27ac的增加。在种子中，动态的H3K27ac变化对两个栽培品种的基因表达几乎没有影响。
Fig 4d
在LN/NN条件下观察到的KN9204和J411根形态变化是否归因于品种特异的H3K27ac变化呢？
为了解决这个问题，作者使用水培系统测试了TSA对小麦幼苗H3K27ac模式的影响，TSA是一种非特异性的I和II类组蛋白去乙酰化酶抑制剂。TSA处理在NN条件下抑制了根的生长。在转录水平上，应激应答相关基因在TSA处理后上调。相反，与根发育有关的基因，参与赤霉素生物合成的基因被下调，导致根的生长受抑制。在表型上，KN9204在TSA处理组和未处理组中均在LN条件下诱导了根的生长，相比NN条件，增加了根尖数量（Fig 4d）。相反，如预期的那样，J411在模拟条件下并未显示LN诱导的根生长。然而，在与TSA处理结合时，J411显示出侧根尖数量显著增加（Fig 4d）。
Fig 4e-f
此外，作者在J411中确定了一些基因，LN条件下H3K27ac减少在TSA处理下得到有效抵消（Fig 4e）。这些基因是根发育过程中的重要组成部分（Fig 4f），在LN条件下上调表达。这个结果强调了TSA处理如何恢复这些基因的更高表达水平，从而促进J411在LN条件下的根生长。总之，TSA处理在缓解J411中大量LN诱导的H3K27ac丧失方面起到了重要作用，最终恢复了J411对LN条件的根生长响应。
结论5 H3K27me3在LN条件下塑造了KN9204和J411中不同的根发育程序
Fig 5a-b
在KN9204和J411中，H3K27me3在旗叶中发生了细微的变化，在根中存在大量差异，但在种子中基本无差异。K均值聚类进一步确定了在KN9204和J411的低氮条件下根中存在不同类别的动态H3K27me3区域（Fig 5a）。
在根部，与KN9204相比，J411的H3K27me3发生了显著的变化（Fig 5a）。此外，在J411中，与LN诱导的H3K27me3增加相关的基因（Fig 5a中的C4、C5和C7）与J411中的下调基因显著重叠（Fig 5b）。
Fig 5c-e
这些基因在根生长相关的过程中富集，包括生长素生物合成、细胞分化调控和根形态发生（Fig 5d）。例如，在J411中，参与根发育的Mob1-like 转录因子在LN条件下H3K27me3增加，表达水平降低，而在KN9204中没有显著变化（Fig 5c）。相反，在KN9204中的H3K27me3增加仅与24个LN下调基因重叠，暗示LN诱导的H3K27me3的增加可能主要减少J411中的根生长过程，但在KN9204中不太明显。KN9204和J411中的H3K27me3丢失与在LN条件下基因表达增加的基因有显著的重叠（Fig 5b）。在J411中，与亚硝酸盐响应、亚硝酸盐转运和硝酸盐同化有关的基因富集，而在KN9204中，与硝酸盐转运、SL和GA生物合成过程以及原始细胞壁生物合成相关的基因富集（Fig 5d）。例如，在J411和KN9204中，TaNRT3.1_4A和ENT-KAURENOIC ACID HYDROXYLASE 2（TaKAO2_4A）的表达在减少的H3K27me3下分别被激活（Fig 5c）。因此，在KN9204中，根部H3K27me3的减少倾向于激活根生长。相反，在J411中，H3K27me3的丧失激活了亚硝酸盐的摄取和代谢。在种子中，KN9204的H3K27me3的增加或丢失并没有导致整体基因表达太大变化。J411中H3K27me3的增加也是如此。然而，H3K27me3的丢失在J411中引发了大量基因表达的上调，尽管没有特定的GO term 富集。
植物中H3K27me3的沉积主要依赖于PRC2。为了深入了解塑造KN9204和J411中H3K27me3差异的原因，作者进行了深入的motif扫描和富集分析。该分析揭示了在KN9204和J411的特定动态H3K27me3区域内特定基序的出现存在某种差异，特别是“CGCCGCC”基序（占50%）和“GAGAGA”重复（占12.9%）（Fig 5e）。值得注意的是，这些motif也存在于拟南芥中的Polycomb响应元件（PRE）片段中。
Fig 5f-g
基于其他物种中TF-DNA识别的情况，作者选择了ERF DOMAIN PROTEIN 9（TaERF9_5B/TaERF9_5D）和BASIC PENTACYSTEINE 1（TaBPC1_4A）作为可能招募PRC2的潜在基因进行验证。有趣的是，TaERF9在KN9204和J411对LN条件的响应中显示出不同的表达模式，特别是在LN条件下，在KN9204中被更高程度地诱导。另一方面，在LN条件下，与KN9204相比，TaBPC1在J411中表达水平更高。
此外，作者在TaERF9_5A的外显子内鉴定到一个SNP，该SNP导致了KN9204和J411之间的氨基酸替代（Lys-Glu）。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，作者验证了TaERF9_5B/TaERF9_5D（AP2/ERF家族）能够与TaEMF2和TaSWN（PRC2的亚基）互作（Fig 5f-g）。重要的是，作者发现TaBPC1_4A能够与TaSWN互作（Fig 5f-g），与之前在拟南芥中的研究一致。因此，不同的转录因子可能介导了KN9204和J411之间LN诱导的不同H3K27me3变化，从而导致不同的根部响应。
结论6 改变H3K27me3可以调节根的发育和低氮条件下对硝酸盐的摄取
Fig 6a-g
作者验证了H3K27me3是否在低氮条件下对根的发育起关键作用。在小麦中，作者鉴定到9个编码H3K27me3甲基转移酶（三个三联体），在不同氮浓度下在根中呈现出不同的表达模式。考虑到在根中TaSWN的高表达以及KN9204和J411的有限的遗传转化效率，作者使用CRISPR-Cas9系统在易于转化的“Bobwhite”背景中创造了SWINGER（TaSWN，TraesC-S4A02G121300，TraesCS4B02G181400和TraesCS4D02G184600）的敲除突变体。
转基因小麦的测序鉴定了一个Taswn-cr纯合系列，其在TaSWN的所有三个亚基因拷贝中都有移码突变。然后，作者使用CUT&TAG比较了Taswn-cr和BW中全基因组的H3K27me3模式。与BW相比，Taswn-cr的H3K27me3峰值数和长度显著减少。同样，与BW相比，Taswn-cr上编码基因上的H3K27me3的强度减少。因此，TaSWN确实是小麦中某些基因组区域的H3K27me3的writer。
随后，作者绘制了BW和Taswn-cr的H3K27me3模式，以了解TaSWN在低氮条件下如何影响它们。K均值聚类确定了在BW和Taswn-cr中，在NN或LN条件下，不同类别的动态H3K27me3区域（Fig 6a）。值得注意的是，动态的H3K27me3峰主要位于远端区域，尤其是对于C1、C3、C6和C7。C1、C2、C6和C8在Taswn-cr中在NN或LN条件下相对于BW显示了减少的H3K27me3，表明是TaSWN依赖的方式（Fig 6a）。
此外，作者还发现，KN9204或J411中约有18%-23%的LN诱导的H3K27me3峰受到了TaSWN的影响（Fig 6b）。与KN9204（n=155）相比，J411中受TaSWN影响的基因更多（n=1463），表明H3K27me3调控在J411中更为显著（Fig 6c）。此外，作者发现在J411中由TaSWN驱动的H3K27me3变化的特定基因组，是在LN/NN条件下发生的（Fig 6d）。对于一些基因（G4和G5），TaSWN可能直接添加H3K27me3，而其他基因（G2和G3）在Taswn-cr中展现出LN诱导的去甲基化，尤其是writer丧失的情况下。
在Taswn-cr中，G1基因在NN条件下H3K27me3较高，但在LN条件下显著下降，原因未知（图6d）。这些基因在根的发育中起着作用，影响生长素运输、干细胞发育以及根构建的转录因子等方面（Fig 6d-e）。此外，在Taswn-cr中，所有基因子集在LN/NN条件下均表现出升高的表达，而在BW中没有变化，与H3K27me3的减少一致（Fig 6f）。相反，在Taswn-cr中，LN/NN条件下的H3K27ac变化主要影响细胞骨架过程，并没有直接影响根的发育。这些发现表明，在J411中，TaSWN对H3K27me3的影响在一定程度上阻碍了低氮条件下的根生长。
Fig 6h-j
因此，作者推测Taswn-cr植株的根生长对低氮的响应可能比BW更敏感。事实上，作者发现在低氮条件下，与 BW 相比，Taswn-cr 的根更为发达，具体体现在总根长和根尖数量上（Fig 6g-h）。此外，在Taswn-cr 中，对低氮的响应中 NRT2 表达的相对水平低于 BW（Fig 6i），与根更为发达的 KN9204 品种相似（Fig 6i）。一致地，通过在低氮条件下进行的15N摄取实验测得的硝酸盐摄取速率在BW中更高，与J411和KN9204的趋势相似（Fig 6j）。
在BW和Taswn-cr之间对根形态变化、硝酸盐摄取速率以及对低氮的转录谱的比较表明，H3K27me3在平衡低氮条件下的根生长和氮代谢中起着重要的作用。改变H3K27me3可能影响小麦品种在显著增加根生长和显著强化氮吸收系统之间做出决策，以适应低氮环境。
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