今天的笔记是关于另一种RNA测序的方法，称为TT-seq。其实这些测序方法在几年前被人们所使用了，但是因为自己并不了解这些知识，所以要慢慢的补起来。

文献题目：TT-seq maps the human transient transcriptome

发表时间：2016
杂志：Science

摘要

基因组的普遍转录产生稳定的和不稳定的RNA（瞬时的）。作者开发了一种瞬时转录组测序（TT-seq），这个方法可以估测RNA合成和降解的速率。使用TT-seq对人类K562细胞进行测序，除了复原了稳定的mRNA和长非编码RNA的map以外，还绘制了瞬时增强子、反义RNA和启动子相关的RNA。TT-seq分析显示增强子RNA寿命短，缺乏U1基序（motif）和二级结构。TT-seq还能绘制短暂RNA下游的聚腺苷酸化位点，并揭示转录终止位点。作者发现，平均四个转录终止位点分布在平均宽度为~3300个碱基对的window中。终止位点与一种与RNA聚合酶暂停相关的motif一致。

正文

真核基因组的转录产生蛋白质编码mRNA和多种非编码RNA（ncRNAs），包括eRNA。大部分的ncRNA会非常快速的被降解，因此不能完全的对它们进行map。然而对于瞬时RNA的绘制图谱对于分析RNA序列、功能和“命运”是非常有必要的。

作者开发了瞬时转录本测序（TT-seq），这个方法绘制转录的活性区域，可以估测RNA合成和降解速率。TT-seq是基于4sU-seq的一项技术，将细胞暴露在核苷类似物4-硫尿核苷中（4sU）（图1A）。4sU在转录过程中被整合到RNA上，被标记有4sU的RNA被分离出来并对其进行测序。4sU-seq比RNA-seq更加灵敏，可以测到瞬时RNA。然而，4sU不能很好的map到人类转录本上，因为只有新生转录本的3’端才可以在4sU暴露期间被标记上，而提前已经存在的5’端区域则优先被测序。为了去掉这个5'端的bias，TT-seq在分离被标记的RNA之前先将RNA片段化（图1A）。因此，TT-seq方法只测定哪些最新被转录的RNA片段，提供了聚合酶在基因组上5分钟内的转录位置。

图1A

当使用人类K562细胞时，TT-seq样品新转录区域是唯一的，而4sU-seq产生5'bias（图S1A）。在TT-seq测序中，短寿命的内含子的覆盖率大概有60%，而在4sU-seq和RNA-seq中分别只有23%和8%（图S1A和S2）。TT-seq是高度可重现的，可完整的mapping转录区域，弥补GRO-cap和CAGE的方法，后二者检测的是RNA的5’端（图1B）。TT-seq可监测RNA合成，而PRO-seq, NET-seq和mNET-seq检测的是RNA与聚合酶的结合。因此，后面几种的方法产生的信号峰在启动子附近（聚合酶停留的地方）（图1B），而TT-seq的峰并不是。对于暂停和激活基因，TT-seq更能揭示RNA在启动子相关的其他区域上RNA的合成（图S1B）。

图S1A：不同测序方法对内含子的覆盖率。

图S2：TT-seq能够均匀地捕捉pre-mRNA，高灵敏度的检测到ncRNA。图是对2500个mRNA表达量最高的转录本的覆盖谱，根据长度进行排序，并对所有测量样本通过平均合并到每10个mRNA的bin中。基于位置的read计数的多少用颜色深浅表示。上面和下面分别代表sense和antisense的覆盖

图1B：比较TT-seq和其他转录谱分析方法。图里展示的是2323个缺少暂停、活化基因的转录unit的平均覆盖，左边是第一个TSS区域，中间是5’端内含子>10kb（包含第一个内含子）的区域。右边是polyA区域。最大信号位于相对于第一个TSS的第一个kbp中。

图S1B：在第一个TSS附近比较TT-seq和其他测序方法。

利用TT-seq数据和分割算法GenoSTAN，作者确定了21,874个明显非间断的基因组间隔转录(转录单位，TUs)(图2和图S4A)。TT-seq高度敏感，可复原GRO-cap的65%的转录起始位点(TSSs)。共有8543个TUs与GENCODE注释在正义方向的转录重叠。该分析检测到7810个mRNA, 302个长非编码RNA (lincRNAs)和431个反义RNA(asRNA)。与编码注释共享长度不到50%的2916个TUs未被分类。剩下的10415(48%)代表了作者新鉴定的ncRNA。

图2：

转录产物来自启动子，也来自增强子，增强子是具有特征染色质修饰的调控元件。为了检测包含潜在的增强子和启动子的染色质区域，作者使用GenoSTAN算法对共激活因子p300和一系列组蛋白修饰(H3K27me3、H3K36me3、H4K20me1、H3K4me1、H3K4me3、H3K9ac和H3K27ac)的 ENCODE ChIP-seq(染色质免疫沉淀测序)数据分析，并对脱氧核糖核酸酶I超敏数据进行分析(图S5A)。在强增强子状态的区域中，81%与至少一个TSS（从GRO-cap）和68%与聚合酶Pol II的峰重叠(图S5, B到D)。

图S5：染色质状态和相应的转录活性的基因组区域。(A)每个染色质Mark和状态(Txn，转录)的平均reads数。(B)累积的FDR与ChromHMM-ENCODE的关系。(C)部分恢复(重叠)GRO-cap测序结果中TSS在4种不同的状态(强启动子,强增强子、弱启动子、弱增强子）与ChromHMM-ENCODE的比较。(D)部分(启动子和增强子)染色质状态与Pol II和TAL1结合的标注，与ChromHMM注释相比较。

TT-seq的动态模型和RNA-seq 数据使我们可以估测RNA合成的降解的速率（图3和图S7）。作者估算在每一个转录位置上磷酸二酯键的形成和断裂，并在TUs内把这些平均，因此获得相对的转录速率和RNA的稳定性。作者发现mRNA和lincRNAs有着最高的合成速率和最长的半衰期。mRNA的平均半衰期是50分钟。其他类型的转录本合成速率比较低，半衰期也更短。这就解释了为什么ncRNA非常难以检测。eRNA的半衰期只有几分钟。短的RNA半衰期也伴随着缺少二级结构（图S7）。eRNA的折叠能量与其他RNA相比，它们的序列只有10%是具有结构的。

图3：不同RNA的半衰期

图S7

TT-seq还可以让我们能够发现转录终止位点(TTSs)。TT-seq检测了瞬时RNA下游的聚腺苷酸化(pA)位点(图S9)。

图S9

这种RNA由于RNA在pA位点裂解而难以检测，导致无保护的5 '端和外切酶降解RNA。总共6977个mRNA基因里作者平均得到4个TTSs，TTS是位于一个终端window，从最后一个pA位点延伸，直到最终的TTS，在最终的TTS处，RNA覆盖率会降到背景水平(图4,a到C)。终止窗口的平均宽度3300 bp，最宽可达10kb宽（图S10），与Pol II占用位置是一致的数据(图4 d)，说明Pol II在TTS处暂停。

图4

图S10

没有对该文献进行全文翻译，只是翻译了一些我觉得应该了解的内容。有兴趣的同学可以自行下载原文阅读~