细胞铺板是细胞实验的第一步，将细胞铺得均匀、密度适宜是对于确保实验结果的准确性、可重复性和可信服性具有不可替代的作用。接下来随小 M 一起看看细胞铺板有哪些秘密诀窍呢~
细胞铺板是细胞生物实验起始的重要步骤，可以说是引领着一个细胞实验成败的关键！其基本原理是将一定数量的细胞均匀，密度合适的接种到培养皿中继续培养，以便后续进行一系列细胞实验。
无论是药物筛选、基因表达研究还是细胞信号通路分析，细胞铺板都是实验设计中的关键步骤。正确的细胞铺板可以确保细胞的健康生长和实验的可重复性，从而获得可靠的实验数据。
01
细胞铺板实验
一、
准备工作
1. 实验材料：细胞培养皿，细胞计数仪，完全培养基，PBS，胰酶，移液枪及枪头等。
小贴士：完全培养基一般是由无血清培养基+胎牛血清 (FBS) +青霉素/链霉素双抗组成。
2. 无菌环境：实验开始前对实验材料进行清洁并无菌处理，如紫外照射。
3. 培养基预热：将完全培养基，PBS，胰酶，置于 37℃ 预热至室温，减少细胞冷应激。
二、
收集细胞
1. 选择细胞：根据实验需求选择生长速度、形态、特性等合适的细胞系或提取原代细胞。
2. 观察细胞状态：将细胞放置在显微镜下观察其生长状态及密度。以贴壁细胞为例，若培养基澄清透明且无漂浮杂质，当细胞生长至 80-90% 密度且状态良好时，则可以进行细胞传代或铺板。
3. 细胞消化：将细胞进行传代，弃去培养基，取适量的 PBS 轻轻润洗 2-3 次，吸尽上清。加入适量的胰酶置于 37℃ 培养箱中消化 (消化时间根据细胞类型而定)，待细胞皱缩且间隙变大、可从皿底滑落且不聚团成块时即可加培养基终止消化。
小贴士：应随时观察细胞消化状态，消化时间太短或太长都会影响细胞状态哦~
三、
细胞计数
将终止消化的细胞轻轻吹打，使细胞完全从皿底脱落。将细胞悬液收集至离心管中，以 800-1000 rpm，3 min 进行离心，弃上清。加入适量的完全培养基充分重悬细胞团块，轻轻吹打混匀后取 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝轻轻混匀，用细胞计数仪进行计数，再根据实验铺板密度的需要计算所需细胞悬液的体积。
四、
细胞铺板
▐ 确定铺板密度
1. 不同孔板铺细胞数 (以 HEK 293 细胞为例) 铺板密度
小贴士： 细胞密度太大容易造成细胞活性差和细胞死亡，细胞密度太小会造成细胞生长缓慢，产物表达降低和污染风险增加。
2. 不同直径的细胞系铺板密度
小贴士：
接种密度：小细胞可以在相对较高的密度下生长，而大细胞需要较低的密度以避免接触抑制。
细胞形态：大细胞通常需要更多空间来扩展和生长。
时间和方法：大细胞细胞生长较慢，需要更长的时间来生长到可传代的状态。在处理和传代时，大细胞需要更温和以减少对细胞的损伤。
3. 实验类型
▐ 铺板操作
确定铺板密度后，根据自己所需的细胞量即可计算所需的细胞悬液体积。
举个栗子：若需要 5 mL 密度为 105/mL 的细胞量，细胞计数结果为 2×106/mL，则吸取 250 μL 的细胞悬液与 4.75 mL 的完全培养基混合即可。
用移液枪吸取适量的细胞悬液 (避免吸取气泡)，在培养皿上方竖直悬空均匀、缓慢地滴加在各个角落。盖上培养皿后沿着水平桌面采用“8”字法或者“十字”形轻轻摇晃培养皿，重复 5-6 次确保使细胞均匀分布在培养皿中，然后进行铺板操作[10]。
小贴士：如何铺的均匀？
答：“8” 字法 or 十字混匀法。
1. 96 孔板：
充分混匀细胞悬液后 (避免产生气泡)，用排枪吸取计数后一定体积的细胞，枪头与孔壁呈 45 ℃ 沿壁缓慢并均匀地将细胞悬液分配到每个孔中。若加样孔太多，建议每铺一部分及时混匀细胞悬液。在接种完成之后，盖上 96 孔板，静止 3-5 min。
2. 其他孔板或者培养皿：
8 字法：以 24 孔板为例，细胞铺完后，贴着水平桌面画 “8” 字轨迹，重复 5-6 次。
十字混匀法：以 24 孔板为例，细胞铺完后，贴着水平桌面先上下移动，再左右移动，呈十字形状，重复 5-6 次。
小贴士：
摇晃过程中应注意力度，防止培养基溅洒出来污染细胞哦~
细胞易沉降，建议每铺一部分孔 (比如半块板)，及时混匀预先配制的细胞悬液，然后继续铺板。
▐ 后续观察
铺完细胞后记得显微镜下观察确认细胞的均匀度和密度，如果你能观察到细胞“颗粒”分明、分布均匀且密度中等，那么恭喜你，细胞铺板工作你已经完美结束啦~赶紧将你的细胞放回恒温培养箱中继续培养啦！
最后！！！千万不要铺完细胞就撒手不管啦~细胞也是有生命的，需要被时时“关爱”与“呵护”的哦~
定期使用显微镜观察细胞形态、增殖情况。
记录细胞生长曲线，评估实验效果。
根据实验目的，适时进行细胞处理 (如药物添加、转染等)，并继续观察细胞。
02
常见问题及可能原因
一、铺完细胞后状态不佳
可能性原因：
1. 细胞的消化时间过长导致细胞损伤，会影响细胞的生长和代谢功能；
2. 细胞培养过程中出现细菌、真菌或霉菌等污染(如果细胞被支原体感染，可尝试用支原体清除剂处理)；
3. 细胞密度过大或过小，影响细胞生长状态；
4. 细胞吹打用力造成细胞机械损伤，影响细胞正常生命活动；
5. 检查培养基，优化培养环境，确保用来铺板的细胞传代次数不多，细胞活力好。
二、细胞密度不均匀
可能性原因：
1. 细胞的消化时间过短或过长，导致细胞消化不充分或细胞结团率太高；
2. 细胞本身性质，偏向于成团生长，如 HepG2。
3. 计数和铺板时，细胞重悬吹打次数太少，未充分混匀，细胞密度分布不均匀；
4. 在进行液体分配时，技术不一致或操作不当可能导致分配不均；
5. 培养环境中的 pH、温度或 CO2 浓度等参数不适合细胞，会影响生长和移动。
三、细胞形态异常或死亡、凋亡
可能性原因：
1. 细胞密度过大或过小，过度拥挤或稀疏；
2. 培养条件不当对细胞造成损伤，比如温度、气体成分和培养基；
3. 培养基组分出现过期或变质；
4. 在重悬和铺板过程中，强烈摇晃或过度机械性操作。
03
小结
除了以上的秘密小技巧外，细胞铺板也离不开操作手法上的经验积累。希望能够帮助到每一位科研工作者顺利、圆满的得到自己想要的实验结果哦！
参考文献：
[1] Bäckström A, et al. A Sample Preparation Protocol for High Throughput Immunofluorescence of Suspension Cells on an Adherent Surface. J Histochem Cytochem. 2020 Jul;68(7):473-489.
[2] Hsu SH, et al. The effect of dynamic culture conditions on endothelial cell seeding and retention on small diameter polyurethane vascular grafts. Med Eng Phys. 2005 Apr;27(3):267-72.
[3] Zhao Y, et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 2014 Sep;6(3):035001.
[4] Foster KA, et al. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp Cell Res. 1998 Sep 15;243(2):359-66.
[5] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16;65(1-2):55-63.
[6] Wu YK, et al. The Influence of Cell Culture Density on the Cytotoxicity of Adipose-Derived Stem Cells Induced by L-Ascorbic Acid-2-Phosphate. Sci Rep. 2020 Jan 9;10(1):104.
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[8] Pijuan J, et al. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019 Jun 14;7:107.
[9] Nallet-Staub F, et al. Cell density sensing alters TGF-β signaling in a cell-type-specific manner, independent from Hippo pathway activation. Dev Cell. 2015 Mar 9;32(5):640-51.
[10] Dr. Jessica Wagener. Cell seeding protocol-Guide on how to seed cells correctly. Lab Academy. 2021 April 13.
