MutScan软件介绍

近期在分析人的一种眼科疾病的WES数据时，发现RPGR基因的第15号外显子的一部分在高度重复区域，该区域是高含量的CT重复，因此前期的文库捕获、后期比对都比较困难。好在我的样本在这个区域的覆盖度还可以，但是常规的流程没有检测出来这个区域的可靠变异，因此需要验证这个区间是否还有漏掉的位点。发现MutScan软件可以基于输入的位点进行验证，从fastq序列入手，不经过bwa比对，而是进行字符串匹配（当然会考虑到容错），找出来一些位点。

1.软件的情况如下：

1.1 源代码网址:

http://www.github.com/OpenGene/MutScan

1.2 下载二进制文件后直接使用:

wget http://opengene.org/MutScan/mutscan
chmod a+x ./mutscan

或者下载可编译文件：

# get source (you can also use browser to download from master or releases)
git clone https://github.com/OpenGene/MutScan.git

# build
cd mutscan
make

# Install
sudo make install

1.3 软件功能：

直接扫描FastQ文件检测和可视化目标突变

1.4 软件特性

超敏感，保证所有支持突变的读取都将被检测到
可以比普通管道快 50 X+ ( 例如。 BWA + Samtools + GATK/VarScan/Mutect).
非常容易使用，无需其他任何东西。没有校准没有参考基因组没有变异电话没有。
包含在癌症相关突变突变点，如 EGFR p.L858R, BRAF p.V600E.。
美观且信息丰富的HTML报表，具有信息pileup可视化。
多线程支持。
支持单端和双端数据。
对于对端数据，MutScan将尝试合并每对，并进行质量调整和错误纠正。
能够扫描一个，文件中的突变，可以用来可以视化被称为变量的变异。
可以用于筛选假阳性突变。换句话说，MutScan可以处理高度repetive序列以避免 false INDEL调用。

应用程序方案：

你对某些特定的( 比如drugable突变) 类型感兴趣，并希望检查给定的FastQ文件是否包含它们。
你对管道调用的突变没有足够的信心，因此你希望可视化并验证它们以避免 false 正调用。
你担心管道使用过于严格的筛选，并且可能会导致某些 false 负数，因这里你要快速检查。
你想看到所谓的变异，并用它清晰的pipeUp信息拍摄一个截图。
你称为大量INDEL突变，并且担心它们主要是 false 优点( 特别是在高度repetive区域)。
你想验证并可视化你的管道调用的VCF中的每个记录。

1.5 Windows 版本( 可能不是最新版本)

如果要在 Windows 上编译 MutScan，则应使用 cygwin。我们已经用 cygwin-2.6.0/G++ 5.4构建了一个，它可以从以下位置下载： http://opengene.org/MutScan/windows_mutscan.zip

1.6 HTML报告

将生成一个HTML报告，并将它的写入给给定的文件名。有关示例，请参阅 http://opengene.org/MutScan/report.html。
如果在Linux服务器中运行命令并希望在本地系统上查看HTML报告，那么。记住要复制所有 xxxx.html 和 xxxx.html.files 并将它们保存在同一文件夹中，然后单击 xxxx.html 在浏览器中查看它。
默认文件 NAME 是 mutscan.html，并且还会生成一个文件夹 mutscan.html.files。
默认情况下，将为每个发现的突变生成一个 indivudal HTML文件。但是你可以指定 -s 或者 --standalone 来包含单个HTML文件中的所有突变。如果扫描太多记录( 例如扫描 VCF )，请注意这个模式，它将给你一个非常大的HTML文件，并且不能加载。
下面是MutScan生成的突变( EGFR p.t790m ) pileup的屏幕截图：

image.png
上面 p.T790M 突变的pileup。 EGFR p.T790M 是肺癌中非常重要的drugable突变。
每个基础的颜色表示它的质量，并且在鼠标超过时显示质量。
第一列，d 表示 MATCH的编辑距离，--> 表示转发，<--表示反向

1.7 JSON报告

默认情况下禁用JSON报告。你可以通过使用 -j 或者 --json 指定一个JSON文件 NAME 来启用它。 JSON报告如下所示：

{
 "command":"./mutscan -1/Users/shifu/data/fq/S010_20170320003-4_ffpedna_pan-cancer-v1_S10_R1_001.fastq -2/Users/shifu/data/fq/S010_20170320003-4_ffpedna_pan-cancer-v1_S10_R2_001.fastq -h z.html -j z.json -v --simplified=off ",
 "version":"1.14.0",
 "time":"2018-05-15 15:48:21",
 "mutations":{
 "NRAS-neg-1-115258747-2-c.35G>C-p.G12A-COSM565":{
 "chr":"chr1",
 "ref":["TGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCA","G","CTGCTCCAACCACCACCAGTTTGTACTCAG"],
 "reads":[
 {
 "breaks":[31,61,62,76], 
 "seq":"ATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCAGCTGCTCCAACCACC",
 "qual":"eeeeeiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiieiiiiiiiiiiieieeeee" },
 {
 "breaks":[31,61,62,76], 
 "seq":"ATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCAGCTGCTCCAACCACC",
 "qual":"eeeeeiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiieeeee" }
 ]
 },
 "PIK3CA-pos-3-178936082-9-c.1624G>A-E542K-COSM760":{
 "chr":"chr3",
 "ref":["AAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCT","A","AAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTAT"],
 "reads":[
 {
 "breaks":[22,52,53,83], 
 "seq":"GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTAAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCCAAAGATGTTTCTCAGAACGCTGCAGTCTGCAATTTGTATGAATTCCC",
 "qual":"eeeeeiiiQiiiiiieiiiieiSeiiiiiie`iiii`i`iiiiiiiiiiiiii`iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiaiiiiiiiiiiiiiiiiiieiiiiiieeeee" },
 {
 "breaks":[0,27,28,58], 
 "seq":"GCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTAAAATCACTGCGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGACCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAGATTCTCTGTTTCTTTTTCTTTATTACAGAAAAAATAACTGACTTTGGCTGATCTCAGCATGTTTTTACCATACC",
 "qual":"AAAAAEEEEiieiiieiiiiiiiiiieiiiiiiiie``iiiiiieiiiiiiiiiieiiiieiieieeiiiSiiiiiieiiiiiiiiiiiiiieiiiiiSiiiiiiiiiiiiieiiiiiiiiiiii`ieiiieiii`ieiiiii`eS``eieEEEAAAAA" }
 ]
 }
 }
}

1.8 软件选项

usage: mutscan -1 <read1_file> -2 <read2_file> [options]...
options:
 -1, --read1 read1 file name, required
 -2, --read2 read2 file name
 -m, --mutation mutation file name, can be a CSV format or a VCF format
 -r, --ref reference fasta file name (only needed when mutation file is a VCF)
 -h, --html filename of html report, default is mutscan.html in work directory
 -j, --json filename of JSON report, default is no JSON report (string [=])
 -t, --thread worker thread number, default is 4
 -S, --support min read support required to report a mutation, default is 2.
 -k, --mark when mutation file is a vcf file, --mark means only process the records with FILTER column is M
 -l, --legacy use legacy mode, usually much slower but may be able to find a little more reads in certain case -s, --standalone output standalone HTML report with single file. Don't use this option when scanning too many target mutations (i.e.> 1000 mutations) -n, --no-original-reads dont output original reads in HTML and text output. Will make HTML report files a bit smaller -?, --help print this message

1.9 示例

纯文本结果，其中包含检测到的突变和它们的支持读取，将直接打印。你可以使用 > 将输出重定向到文件，例如：

mutscan -1 <read1_file_name> -2 <read2_file_name > result.txt

MutScan生成非常有用的HTML文件报告，默认为工作目录中的`mutscan.html`。你可以使用 `-h` 参数更改文件 NAME，例如：

mutscan -1 <read1_file_name> -2 <read2_file_name> -h report.html

对于单端排序数据，省略 `-2` 参数：

mutscan -1 <read1_file_name>

多线程

-t 参数指定要启动的工作线程数。默认的线程号是 4。建议使用比系统的CPU内核少的数字。

变异文件

由 -m 指定的变异文件可以是 CSV file，也可以是 VCF file。
如果没有指定 -m，MutScan将使用内置的默认变异文件，其中包含 60个相关的癌症相关突变点。
如果提供了 CSV，则不需要参考基因组程序集。
如果提供 VCF，应提供相应的参考基因组程序集( 例如 )。 ucsc.hg19. fasta )，并且不应该被压缩。

格式的csv格式变异文件

带有 name，left_seq_of_mutation_point，mutation_seq，right_seq_of_mutation_point 和 chromosome(optional) 列的CSV文件:

#name, left_seq_of_mutation_point, mutation_seq, right_seq_of_mutation_point, chromosome

NRAS-neg-1-115258748-2-c.34G>A-p.G12S-COSM563, GGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCAC, T, TGCTCCAACCACCACCAGTTTGTACTCAGT, chr1

NRAS-neg-1-115252203-2-c.437C>T-p.A146V-COSM4170228, TGAAAGCTGTACCATACCTGTCTGGTCTTG, A, CTGAGGTTTCAATGAATGGAATCCCGTAAC, chr1

BRAF-neg-7-140453136-15-c.1799T>A -V600E-COSM476, AACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTC, T, CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTA, chr7

EGFR-pos-7-55241677-18-c.2125G>A-p.E709K-COSM12988, CCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAG, A, AAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGG, chr7

EGFR-pos-7-55241707-18-c.2155G>A-p.G719S-COSM6252, GAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG, A, GCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGG, chr7

EGFR-pos-7-55241707-18-c.2155G>T-p.G719C-COSM6253, GAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG, T, GCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGG, chr7

testdata/mutations.csv 给出了csv格式变异文件的示例

vcf格式变异文件

标准VCF可以作为一个变异文件，文件扩展名为 .vcf 或者 .vcf。如果突变文件是VCF文件，你应该通过 -r <ref.fa> 指定 reference assembly file。例如命令可以是:

mutscan -1 R1.fq -2 R2.fq -m target.vcf -r hg19.fa

使用 bam/fill

如果希望使用 bam/fill文件运行 MutScan，可以使用 samtools 将它们转换为FASTQ文件，使用 samtools fastq 命令，最新版本的samtools fastq 数据支持 paired。

注释

如果你读得太短，MutScan 需要至少 50个长读，不要使用它
如果你希望只使用一个读取支持来提取突变，请在命令中添加 -S 1 或者 --support=1

2. 一些说明：

（1）相关的网站：
https://github.com/OpenGene/MutScan#get-mutscan

https://www.biostars.org/p/213988/

https://www.biostars.org/p/283969/#283980

https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-018-2024-6

（2）关于indel模式，创建vcf时的格式：
如果变异类型是insertion，则直接把变异后的序列作为M序列，如下图中的红色框内：

image.png

对于deletion类型：

（3）该软件更像是验证变异位点，不是call 变异，是需要把已知的位点先填入的。