Apoptosis
- 为程序性细胞死亡，起因可能因为外界环境、生长发育等因素而导致自然死亡现象。当细胞发生apoptosis时，会发生细胞膜PS由内外翻至细胞外、线粒体膜电位改变、Caspase活化。DNA fragmentation,一连串的反应使细胞裂解形成凋亡小体，被巨噬细胞识别并清除。
检测方法
Step 1：Annexin V binding assay / 细胞膜 PS 外翻
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凋亡细胞在早期Phosphatidyl-serine(PS)会由细胞膜内外翻至膜外，利用Annexin V检测能让您作为最快速方便的apoptosis指示：
1.只需15分钟，让您快速检测早期apoptosis指示
2.无须固定，活细胞即可检测
3.可利用Flow cytometry或immunofiuorescence分析结果
4.选择性多，可搭配Kit或是抗体
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Annexin V binding assay / 细胞膜 PS 外翻原理
- 以Annexin V-FITC标示外翻的PS,再合并以PI进行的死亡细胞的染色,以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin V-FITC染成绿色，但对PI拒染；已死亡或Apoptosis后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin V-FITC与PI;健康的细胞则无法染上Annexin V-FITC或PI。
protocol
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注意事项
Tips:
- 由于凋亡检测的为活细胞,因此整个收集细胞的操作过程尽量保持细胞活性,避免人为的损伤细胞,如:避免用力吹打细胞,避免胰酶消化时间过长,用冰浴的PBS清洗细胞,缩短上机检测的时间。
- Annexin-V染料上带FITC荧光，因此从染色开始注意避光操作和孵育，一般尽量在染色后半个小时内上机检测。
- 如果处理的细胞中含有GFP会干扰FITC的荧光信号，应该更换不同波长的荧光染料标记的Annexin-V。
- 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin-V结合，从而干扰实验结果。
- 在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V 与PS的结合,若胞内已转染GFP，建议使用AnnexinV-PE。
参考网址：http://blog.sina.com.cn/s/blog_73a963ea0102whu2.html
细胞周期检测
原理
PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
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protocol
- 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约10e6)
- 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm * 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;
- 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）
- 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。移至1.5ml EP管中, 轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。加入20 μLRNase（储存浓度25 mg/mL，PBS 稀释成1mg/ml，工作浓度50ug/ml），重悬细胞，37 ℃水浴消化 30 min；加入PI 20ul至终浓度50ug/ml（储存液浓度25mg/ml, PBS稀释1mg/ml加入10ul）锡箔纸包住，避光4度染色30min，24h内上机检测。充分混匀细胞，用 200 目滤网过滤后，便可利用流式细胞仪进行细胞周期。
- 数据的收集和分析
流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
Viable cell---PI阴性Annexin V阴性细胞
Early apoptotic cell ---PI阴性Annexin V阳性细胞
Dead---PI阳性Annexin V阳性细胞
参见：流式联盟，医福会
