P4HA1, a Prognostic Biomarker that Correlates With Immune Infiltrates in Lung Adenocarcinoma and Pan-Cancer

P4HA1，一个与肺腺癌和泛癌的免疫浸润相关的预后性生物标志物

发表期刊：Front Cell Dev Biol

发表日期：2021 Dec 13

DOI:  10.3389/fcell.2021.754580

期刊相关信息

一、背景

        癌症是人类死亡的主要原因。尽管近年来癌症相关的治疗技术取得了巨大的进步，但病人的预后仍然很低，主要是因为大多数病人是在最后阶段被诊断出来的，缺乏有效的特定治疗目标。肿瘤免疫疗法，如免疫检查点阻断抑制剂，已经彻底改变了癌症患者的预后，但大多数患者仍然对免疫疗法不敏感。研究表明，免疫抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）在发展肿瘤进展和削弱肿瘤患者对免疫治疗的反应方面至关重要。TIME中的免疫细胞被重塑，失去了原有的功能。

        脯氨酰4-羟化酶，α多肽I（P4HA1）是胶原蛋白合成的关键酶，包括两个相同的α亚基和两个β亚基。胶原蛋白是肿瘤微环境的主要组成部分，参与癌症纤维化，增加肿瘤组织硬度，调节肿瘤免疫力，促进肿瘤转移。

二、材料与方法

1.数据来源

1）从UCSC Xena数据库下载癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）和癌症细胞系百科全书（CCLE）的表达谱和临床信息

2）从已发表的研究（Thorsson等，2018）、TIMER2数据库和ImmuCellAI数据库下载TCGA的免疫细胞浸润数据

3）从cBioPortal数据库下载P4HA1的甲基化和CNA

2.实验流程

1）预后分析：使用R软件包 "survminer "和 "survival "进行Kaplan-Meier分析和单变量Cox回归（UniCox），探索P4HA1对患者生存的影响。评估总生存期（OS）和疾病特异性生存期（DSS）。

2）相关性和基因组富集分析：使用TCGA泛癌数据对P4HA1表达水平和所有蛋白编码基因进行了相关分析；对与P4HA1相关的基因（P<0.05）进行排序并进行GSEA分析

3）药物反应分析：192种药物的IC50值和809个细胞系的基因表达谱从癌症药物敏感性基因组学数据库下载，分析了P4HA1表达与192种药物的IC50值之间的相关性

三、实验结果

01 - P4HA1在泛癌中的表达情况

        作者首先利用TCGA、GTEx和CCLE数据评估了P4HA1的表达，发现P4HA1在33种癌症类型中的26种存在过度表达。此外，P4HA1仅在两种肿瘤类型中表达较低，如KICH和LAML（图1A）。为了比较P4HA1仅在肿瘤组织中的表达，发现P4HA1在KIRC中高表达，在KICH中最低（图1B）。在GTEx数据库的正常组织中，结果显示P4HA1在骨髓组织中表达最高，在胰腺中表达最低（图1C）。至于肿瘤细胞系，作者用CCLE数据库的数据证明，P4HA1在GBM细胞系中表达最高（图1D）。

图1 P4HA1在泛癌中的表达

        关于TCGA队列中的肿瘤和邻近的正常组织，P4HA1也在12种癌症中过度表达（图2A-L）。作者还研究了P4HA1在不同肿瘤阶段的表达。结果显示，在ACC、CESC、HNSC、KIRP、LUAD、PAAD和THCA中，相对较差的肿瘤阶段中P4HA1的表达在是升高的（图2M-S）。

图2 P4HA1在成对的肿瘤和邻近的正常组织以及不同肿瘤阶段的表达情况

02 - 泛癌中P4HA1的基因改变

        突变、DNA甲基化和CNA是影响基因表达的因素；因此，作者对P4HA1进行评估。发现在黑色素瘤患者中观察到P4HA1的最高改变频率（>4%），其中 " Mutation "是主要类型（图3A）。对于P4HA1和CNA的相关性，发现在33种肿瘤类型中的18种肿瘤中P4HA1的表达与CNA呈正相关（图3B），说明CNA的升高是泛癌中P4HA1高表达的主要原因之一。此外，发现在33种肿瘤类型中的24种中，P4HA1的启动子甲基化水平与P4HA1表达呈负相关，这也诱发了P4HA1的高表达（图3C）。

图3 P4HA1的基因改变

03 - P4HA1的预后价值

        为了评估P4HA1在预测肿瘤患者预后方面的价值，进行了单变量Cox回归（UniCox）和Kaplan-Meier生存分析。Kaplan-Meier OS分析证明，P4HA1表达的升高预示着ACC、BLCA、BRCA、CESC、GBM、HNSC、KICH、KIRP、LUAD、MESO、OV、PAAD、PCPG、SARC、STAD、YHCA、THYM和UVM患者的OS更差（图4）。

图4 P4HA1的预后价值

        UniCox结果显示，P4HA1是ACC、BRCA、CESC、HNSC、KICH、KIRP、LUAD、MESO、PAAD、SARC、THCA和UVM患者OS的一个风险因素（图5A）。此外，作者评估了P4HA1在预测DSS方面的预后价值。结果显示，P4HA1高表达预示着BRCA、CESC、HNSC、KIRP、LUAD、MESO、PAAD、SARC、THCA和UVM患者的DSS状态较差，但预示着KIRC患者的DSS状态较好（图5B）。

图5 P4HA1的UniCox分析

04 - P4HA1的GSEA

        为了探索P4HA1参与泛癌的可能路径，作者在Reactome通路数据库基础上进行了GSEA。如图6所示，GSEA结果显示，P4HA1参与了泛癌的免疫调节相关途径，如免疫系统的细胞因子信号，先天免疫系统和适应性免疫系统。

图6 P4HA1在泛癌中的GSEA

        此外，为了研究P4HA1参与LUAD的潜在途径，作者利用TCGA-LUAD数据对P4HA1进行了GSEA，计算了所有蛋白编码基因和P4HA1之间的相关性，并选择有意义的基因（P < 0.05）进行GSEA。图7A,B显示了与P4HA1最正相关和负相关的前50个基因。对于GSEA-GO的结果，发现P4HA1在大多数与细胞周期相关的术语中都是富集的（图7C）。对于基于KEGG和Reactome的GSEA结果，P4HA1在细胞周期、自噬-动物、hippo信号通路、mTOR信号通路、适应性免疫系统和先天免疫系统通路中富集（图7D，E）。这些结果表明，P4HA1调节的细胞周期和免疫相关途径可能导致肿瘤患者的不良生存。

图7 P4HA1在LUAD中的GSEA

05 - P4HA1表达与免疫细胞浸润之间的关系

        通过使用已发表的研究中的免疫细胞浸润数据分析P4HA1表达与免疫细胞浸润之间的相关性，作者发现P4HA1与大多数肿瘤类型（包括LUAD）中的TAMs浸润呈正相关（图8A-C），但与免疫杀伤细胞，如LUAD中的活化NK细胞、CD8 T细胞和淋巴细胞呈负相关（图8D-F）。

图8 基于已发表的研究数据的免疫浸润分析

        作者还利用ImmuCellAI数据库的数据发现了一个类似的现象。免疫抑制细胞，如nTreg、iTreg和TAMs，在泛癌（图9A）和LUAD（图9B）中与P4HA1表达呈正相关。相反，免疫杀伤细胞，如活化的NK细胞和CD8 T细胞，与P4HA1的表达呈负相关。从TIMER2数据库的数据分析结果中也观察到类似的结论（图10）。

图9 基于ImmuCellAI数据库数据的免疫浸润分析

图10 基于TIMER2数据库数据的免疫浸润分析

        此外，作者发现在几种肿瘤类型中，P4HA1的表达与肿瘤突变负担（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）呈正相关，显示了与免疫疗法疗效的潜在联系（图11A,B）。此外，根据P4HA1的中位表达量将LUAD患者分为两组，并比较两组之间基因突变的差异。结果表明，在LUAD中，P4HA1高表达的患者比P4HA1低表达的患者拥有更高的基因突变频率（高与低：86.9%与80.88%）（图12A，B）。

图11 P4HA1的表达与TMB和MSI的相关性

图12 LUAD中高低P4HA1组之间的基因突变

        作者对P4HA1和192种抗癌药物的IC50值进行了相关分析，发现P4HA1高表达的患者可能对大多数抗癌药物有耐药性，如PF-4708671、TAF1_5496、Linsitinib、ABT737、Navitoclax和ML323（图13）。

图13 P4HA1的表达与抗癌药物的IC50值的相关性

        总之，研究结果显示，P4HA1在泛癌和LUAD中作为一种致癌基因和预后标志物，P4HA1的高表达可能有助于相对免疫抑制微环境。

四、结论

        本文对P4HA1在泛癌中的功能进行了全面的生物信息学分析，发现P4HA1是泛癌的潜在预后生物标志物和治疗靶点。由于P4HA1介导的高胶原蛋白沉积在肿瘤微环境和肿瘤进展中至关重要，新的治疗策略或小分子抑制剂正在开发中，以胶原蛋白的合成为目标进行癌症治疗，这将是未来癌症研究的一个重要方向。