关键词：基因表达差异分析、Differential Expression Genes、设计矩阵、Design Matrix、比较矩阵、Contrast Matrix
本文参考自C.W Law等人的方法文章：A guide to creating design matrices for gene expression experiments。不是完整翻译！查缺补漏请参考：
Law CW, Zeglinski K, Dong X et al. A guide to creating design matrices for gene expression experiments [version 1; peer review: 2 approved]. F1000Research 2020, 9:1444 (https://doi.org/10.12688/f1000research.27893.1)
文章概述：
基因组数据，如RNA-seq，的差异表达分析使用线性模型来确定基因表达变化的大小和方向。对于RNA-seq，已存在一些软件包和工作流程。然而，在分析过程中有两个关键步骤可能会成为许多人的绊脚石——通过设计矩阵（Design matrices）建立适当的模型以及通过对比矩阵（Contrast matrices）设置感兴趣的比较。目前并不存在一个普适的设计矩阵和对比矩阵。本文指导读者建立设计矩阵和对比矩阵的基础。文章从简单的例子开始（例如具有单一解释变量的模型），然后转向更复杂的例子（例如交互作用模型、混合效应模型、更高阶的时间序列和周期性模型），并且为每个案例研究提供代码和图形表示。文章主要是以Limma包的风格为基础。
基础模型
本节概述一些基本模型的一般形式。
1. 协变量回归模型 - Regression model for covariates
开始，让我们考虑两种类型的解释变量（explanatory variables）：协变量（covariates）和因子（factors）。协变量包含与实验样本相关的定量测量值。这些可以是个体的年龄或体重，或样品的其他分子或细胞表型，例如从聚合酶链反应（PCR）实验或荧光激活细胞分选（FACS）获得的测量结果。对于协变量，通常感兴趣的是知道响应和协变量之间的变化率，例如“年龄每增加一个单位，特定基因的表达增加/减少多少？”。我们可以用一条直线来模拟或描述这种关系，它采用:
的形式，其中直线由
截距
和斜率
定义（图1）。在这个模型中，年龄协变量取连续的数值，如
等。我们通常将这个模型称为回归模型（regression model），其中斜率表示变化率，或者协变量每增加一个单位，预期基因表达增加/减少多少。直线的
轴截距和斜率或
（
和
）称为模型参数。参数的真实值是未知的，但在建模过程中可以估计。模型参数的正估计值表明解释变量对基因表达具有正影响（斜率增加），而负值表明解释变量对基因表达具有负影响（斜率减小）。在某些情况下，可以将年龄协变量转换为因子，将较小的值归类为“young”，将较大的值归类为“mature”，并使用下面描述的模型。
2. 因子变量均值模型 - Means model for factors
因子是与实验中的样本相关联的分类变量（categorical variables）或分类器（classifiers）。它们通常分为生物学性质的（例如disease status, genotype, treatment, cell-type）和技术性质的（experiment time, sample batch, handling technician, sequencing lane）。因子中的唯一值（unique values）称为Levels（水平）。例如，作为因子的基因型可包含两个Level，“wildtype”和“mutant.”。在此，通常感兴趣的是确定该因子每个Level基因表达的期望值或者平均值。基因表达和因子之间的关系可以用：
的形式描述或建模，其中
代表野生型的平均基因表达，
代表突变体的平均基因表达（图1）。与协变量年龄可以取任何非负数值不同，基因型Level只能取0或1的数值。例如，当确定wildtype组的期望表达时，wildtype等于1（mutant等于0），使得：
类似地，当确定mutant组的预期表达时，mutant等于1（wildtype等于0），使得：
注意，wildtype和mutant“轮流”取0和1值。这是因为将样本的分类wildtype和mutant是相互排斥的，样本不能同时为wildtype和mutant，或者既不是wildtype也不是mutant。该模型将期望或者平均基因表达估计为
或
，其中
为wildtype中表达值的平均值，
为mutant表达值的平均值。换句话说，
（或模型参数）估计为基因型因子中每个Level的平均值，如图1中不同的实线所示。图1中的每条水平线都是由其y轴截距（斜率为0）定义的，它们本身就是回归模型。然而，由于模型参数表示组平均值，因此我们具体地将这种类型的模型称为均值模型。这也使我们能够将这些模型与应用于协变量的一般回归模型（y轴截距和斜率均可以为非零）区分开来。如对协变量的描述，模型参数的真实值未知，但可估计。虽然每个因子Level的期望表达值是信息性的，但通常关键关注的是Level之间的表达差异，例如，“wildtype和mutant之间的表达差异是什么？"。Level间的差异使用参数的线性组合（一种奇特的说法，即为每个参数乘以一个常数）来计算，也就是对比（contrasts）。例如，对比为
计算
，即wildtype和mutant之间的平均值差异。
3. 因子变量均值参考模型 - Mean-reference model for factors
均值模型的另一种参数化是直接计算wildtype和mutant之间的基因表达差异。它通过使用其中一个Level作为参考进行操作。这样的模型被参数化用于参考水平（reference level，例如wildtype）的平均表达，而其余Level相对于reference level被参数化（例如wildtype和mutant之间的差异）。基因表达和基因型之间的关系可以用下面的形式建模：
其中
代表wildtype型的基因表达均值，
是mutant型和wildtype型均值之间的差异（图1）。在此，当确定wildtype组的期望基因表达时，式子中的mutant取0，使得wildtype型的表达为：
另一方面，当确定mutant组的期望表达时，mutant等于1，使得突变体的表达为：
wildtype型的期望基因表达直接由第一个模型参数
表示，并在图1中以实线表示。而mutant的期望基因表达计算为两个参数的总和，并在图1中以虚线表示。与均值模型一样，这里演示的模型本身也是一个回归模型。然而，我们将此模型特别称为均值参考模型，以将其与我们用于协变量解释变量的一般模型形式区分开来。均值模型和均值参考模型是参数化不同的等效模型，模型的形式不同，但从两个模型中获得wildtype型和mutant型的基因期望表达值相等。
基因表达相关分析设计矩阵指南（Ⅱ）会更新介绍各种解释变量的模型
