使用DEseq2对RNA-seq数据进行分析，并计算FPKM和TPM。

该过程使用GenomicFeatures包获取外显子长度，并计算非重叠外显子长度之和作为基因长度。选取这一因素作为基因长度是参考文章https://www.jianshu.com/p/3c21da32d7a4

step1. 安装并加载包：

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager",repos = "https://mirrors.tongji.edu.cn/CRAN/") if (!requireNamespace("GenomicFeatures", quietly = TRUE)) BiocManager::install("GenomicFeatures") if (!requireNamespace("DESeq2", quietly = TRUE)) BiocManager::install("DESeq2")

library(GenomicFeatures)

library(DESeq2)

step2. 读取gtf文件，计算基因长度：

txdb <- makeTxDbFromGFF("84kV1_3.gtf", format = "gtf", circ_seqs = character())

  ebg <- exonsBy(txdb, by="gene")

  exon_gene_sizes <- sum(width(reduce(ebg)))

step3. 读取DEseq2所需文件：

data_in = read.csv("mycounts1.csv", head=TRUE,row.names =1, check.names = FALSE)

countData = as.data.frame(data_in)

colData = read.csv("mymeta-hj.csv", head=TRUE)

names(colData)=c("id", "condition")

step4. 构建DEseq2数据，并使用fpkm()计算FPKM值

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData,

                                colData = colData,

                                design = ~ condition)

  mcols(dds)$basepairs <- exon_gene_sizes

  fpkm_out = fpkm(dds)

  write.table(as.data.frame(fpkm_out), file="fpkm_out.txt",sep="\t",quote = FALSE)

注：这一步本来使用的rowRanges(dds)<- ebg ，但后续分析过程中发现，这样导入基因长度可能会出现counts和length不匹配的情况，即将一个基因的长度赋值给另一个基因。原因是 ebg <- exonsBy(txdb, by="gene")这一步会按照基因id排序，而countDATA是按照输入counts文件的基因顺序，rowRanges并没有按照基因id将数据合并，而是直接合并。使用mcols(dds)$basepairs的方式可以避免这一情况，将数据按照geneid合并。

step5. FPKM转换成TPM

fpkm<-read.table("fpkm_out.txt", sep = "\t", head=TRUE, row.names = 1, check.names = FALSE)

head(fpkm)

fpkmToTpm <- function(fpkm){

  exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6))

}

tpms <- data.frame(apply(fpkm,2,fpkmToTpm), check.names = FALSE)

head(tpms)

colSums(tpms)

write.table(as.data.frame(tpms), file="TPM_out.txt",sep="\t",quote = FALSE)