SQSTM1/p62 知多少？
原创 瞿飞；经作者同意转自 Autophagy
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导语： Sequestosome-1（ 是一种重要的选择性自噬接头蛋白，其含有泛素相关结构域、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白的作用区、微管相关蛋白1A/1B轻链3作用域、肿瘤坏死因子受体相关因子6、Phox和Bem1p结构域和ZZ 型锌指区6个功能区域。SQSTM1/p62在清除泛素化蛋白中起着重要作用，它同时调节核转录相关因子2-抗氧化反应元件、NF-κB 和胱天蛋白酶8 介导的凋亡等信号通路；SQSTM1/p62的异常表达与神经退行性病变（如亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病）、肿瘤、感染性疾病、遗传性疾病以及慢性疾病的发生发展过程密切相关。
自噬是真核细胞内高度保守的溶酶体介导的降解机制，主要负责清除错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等，对于维持细胞稳态起着重要作用。根据底物靶向运输至溶酶体方式的不同，自噬可分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导自噬。通常所说的自噬主要指大自噬，其基本过程包括自噬启动、前自噬泡膜延长、自噬泡膜闭合形成直径约为1 μm的自噬体、自噬体与溶酶体融合、以及自噬溶酶体内底物的降解。最初普遍认为自噬是非选择性的，如营养缺乏能诱导细胞产生非选择性自噬，细胞通过吞噬降解一些非必需细胞成分包括蛋白质和细胞器，以提供能量和关键的代谢物质如氨基酸，维持细胞的基础代谢和存活。然而，近年研究发现自噬可通过受体蛋白选择性地清除细胞内的蛋白质聚合物、受损的细胞器（如线粒体和过氧化物酶体）。 SQSTM1/p6是第一个被发现的具有这种功能的受体，越来越多的证据支持p62与神经退行性疾病、免疫性疾病和人类肿瘤等多种疾病发生有关。
1、SQSTM1/p62蛋白
SQSTM1/p62 是一种多功能的蛋白，在大鼠、小鼠、人类和果蝇中分别称为ZIP，A170，SQSTM1和 Ref2cp。SQSTM1/p62 分子质量是 62 ku，在胞浆中以散在点状或者聚集形式存在，可在胞质和细胞核间转运，最初是作为非典型蛋白激酶 C（atypical protein kinase C，aPKC）的配体被发现的。p62蛋白含440个氨基酸，主要包括6个功能区：①位于C端的能连接泛素化底物的泛素结合结构域；②同泛素接头蛋白 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1相互作用的Keap1作用区；③同自噬体膜上的受体蛋白微管相关蛋白 1A/1B轻链3，LC3相互作用的结构域；④同E3泛素连接酶肿瘤坏死因子受体相关因子6，TRAF6结合的TRAF6 结构域；⑤同受体作用蛋白1蛋白激酶结合的 ZZ 型锌指结构域；⑥处于 N 端的A、B 类型 Phox 和 Bem1p（PB1）结构域，其可以通过自身聚合或与 PKC、细胞外信号调节激酶 5的激酶、BRCA1 基因1邻位蛋白和p62等作用形成同二聚体或异二聚体。p62的多功能结构使之成为多个信号通路中心，参与细胞基本功能的维持与调控。因此，p62/SQSTM 1功能异常能导致多种信号通路的受阻、蛋白异常聚集从而诱导各种疾病的发生。
2、SQSTM1/p62在细胞内蛋白质代谢中的作用
细胞在生长代谢和应激过程中会不断产生一些错误折叠的蛋白和受损的细胞器等，及时清除这些底物是细胞维持自身稳态和正常生理活动的关键。真核细胞主要依靠自噬-溶酶体和泛素-蛋白酶体系（ubiquitin-proteasomesystem，UPS）两种蛋白降解机制来完成细胞内蛋白质的新陈代谢。其中，UPS主要清除一些可溶性小分子蛋白，而自噬-溶酶体则负责清除蛋白聚合物和受损的细胞器。
根据靶蛋白的属性，自噬可分为非选择性自噬和选择性自噬。尽管两者有许多共同的机制，但在调控机制上还是有许多不同之处。例如，在哺乳动物细胞中，被选择性自噬降解的蛋白通常都是特定化学修饰的蛋白，如泛素化蛋白。同时，选择性自噬通常需要一些接头蛋白如p62和NBR1的存在，这些蛋白具有泛素结合结构域和LC3相互作用的模序，因此能结合泛素化修饰的蛋白，并运输到自噬体。
作为重要的选择性自噬接头蛋白p62在清除泛素化蛋白过程中作为受体参与其中。研究发现，p62主要通过其UBA（Ser403位点）结构域、LIR（Ser351位点）结构域的磷酸化，分别与泛素化蛋白和 LC3/Atg8 连接，同时通过 PB1 发生自身寡聚化，最终进入自噬溶酶体完成泛素化底物降解。此外，p62也可将泛素化蛋白运送到蛋白酶体降解。正是依赖p62的枢纽作用，细胞内的两个主要蛋白降解机制建立起了内在的联系，二者相互依赖，相互补充。由于UPS主要清除一些可溶性小分子蛋白，因此，当蛋白酶体功能出现故障以及大量聚集性蛋白出现时，自噬就成为唯一的清除途径。同时，细胞内受损的或衰老的细胞器也可通过自噬途径降解。例如，p62能通过Pink1-Parkin介导泛素的线粒体的清除，有研究报道，Pink1是一种重要的线粒体激酶，在Parkin 蛋白上游发挥作用当使用解偶联剂、羰基氰化间氯苯腙处理之后，Pink1 发生积累，进而招募到受损线粒体上。与此同时，p62 通过电压依赖性阴离子通道蛋白1（volt⁃age-dependent anion channel 1 protein，VDAC1）在线粒体膜上聚集，最后经p62-LC3进入自噬-溶酶体系统降解。
由于在溶酶体降解过程中，与底物结合的p62被蛋白水解酶降解。因此，p62水平升高通常被认为是自噬活性受到抑制的标志。在实际检测过程中，p62水平升高与自噬激活相伴随的现象并不少见，特别是在毒物刺激和氧化应激情况下更为常见。其原因可能是p62作为一种应激蛋白，在应激条件下其表达水平会大幅度上调，这一过程主要受转录因子 EB（transcription factor EB，TFEB）调控。正是鉴于 p62 与自噬之间的复杂关系，同时由于细胞自噬本身是一个高度动态的、多阶段的过程。因此，在判定细胞自噬活性变化时，需要评价自噬流的变化，即自噬体形成、自噬体与溶酶体融合、底物降解等的动态变化。
p62与自噬的关系具有双向性。一方面细胞内p62水平严格受自噬活性的调控，另一方面p62也能通过激活哺乳类动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白复合物1〔mammalian target of sirolimus（rapamycin）complex 1，mTORC1〕信号通路负性调节细胞的自噬活性。mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能形成两种复合物，一种与 mTOR调节相关蛋白（regulatory- associated protein of mTOR，raptor）结合形成mTORC1，一种是与西罗莫司不敏感的mTOR伴侣（Rapamycin insensitive companion of mTOR，rictor）形成mTORC2。其中，p62可通过直接作用raptor蛋白，激活 mTORC1复合物抑制细胞自噬活性。p62的缺失会降低mTORC1的活性，相反过度表达p62 会提高活性。自噬抑制会导致p62的聚集，然后会提高mTORC1的水平，继而进一步抑制自噬，促使p62聚集。
3、与p62功能相关的信号调控通路
近年研究发现，p62不仅在细胞蛋白质量控制中起关键作用，更为重要的是它还能通过自身的寡聚化，参与细胞内多条重要信号通路的调控。
3.1、p62与核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件信号通路
氧化应激是指机体内氧化与抗氧化系统失衡所导致的一系列适应性反应。大量积累的活性氧和活性氮能引起细胞内蛋白质、脂类和DNA等重要生物大分子的损伤，因此，氧化应激被认为与神经退行性疾病、动脉粥样硬化和肿瘤等多种人类疾病发生有关。核转录相关因子核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）-抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路是近年发现的机体抵抗内外环境氧化和化学等刺激的重要防御性转导通路。
Nrf2 是属于碱性亮氨酸拉链（bZIP 蛋白）家族的转录因子。生理条件下，Nrf2在细胞质中与滞蛋白（cullin）-3型泛素连接酶接头蛋白Keap1结合处于非活性状态，并由蛋白酶体降解。当细胞暴露于亲电子物（electrophile）、活性氧和受化学物质刺激时，Keap1 的半胱氨酸残基发生化学修饰，引起其构象改变，导致Nrf2与Keap1解离而活化。活化的Nrf2转位进入细胞核，与ARE结合，启动ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体/分子伴侣等基因转录和表达以抵抗内外界的有害刺激。
最近研究证明，在自噬活性受到抑制引起胞内p62 大量聚集时，p62 能直接激活该信号通路。其作用机制是胞内大量聚集的p62在蛋白激酶作用下特定氨基酸位点发生磷酸化（主要磷酸化位点是Ser403 和 Ser351）。磷酸化的p62 通过 KIR 区域结合 Keap1，释放 Nrf2，从而入核启动下游基因表达（图1）。尤其值得关注的是，p62与Nrf2二者之间存在一个正反馈的关系。即p62增加，能激活Nrf2 通路，促进下游基因的表达，其中包括 p62 基因，因而能进一步加剧p62的聚集。
负责 p62 磷酸化的蛋白激酶迄今尚未真正确认。有证据显示，mTOR和蛋白激酶CK2的激活可能与 p62 过度磷酸化有关。最新的研究提示UNC51 样激酶 1（UNC-51-like kinase-1，ULK1）与 p62 磷酸化有关。总之，至于是何种激酶直接负责p62的磷酸化仍待进一步研究证实。
Nrf2-ARE信号通路不仅在自噬缺陷的小鼠肝中被激活，且在多种细胞应激反应和抵御氧化损伤中起关键作用。近年研究证实，许多药物和植物提取物，如非诺贝特（fenofibrate）和黄酮槲皮素（flavonoidquercetin）正是通过激活 Nrf2 信号通路而发挥作用的。此外研究还发现，生长调控因子sestrin也能通过p62依赖的自噬性Keap-1降解方式来激活Nrf2信号通路。
3. 2、p62与NF-κB信号通路
NF-κB是包含 5 个亚单位的转录因子蛋白家族，通常情况下，它与核因子抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）形成复合物以无活性的形式存在于胞浆中。在细胞受到外界刺激的条件下，IκB 激酶（IκB kinase，IKK）激酶活化引起 IκB 磷酸化，磷酸化的 IκB 经泛素化后被降解，从而释放出 NF-κB。随后NF-κB进入细胞核与靶序列结合，启动下游相关基因的转录。NF-κB 通路对于细胞生存具有重大意义，参与免疫炎症反应过程中诸多活性分子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），白细胞介素（interleukin，IL）-1β，IL-2，IL-6和IL-8等表达的调控，与炎性反应、肿瘤形成等多种病理生理过程有关。
目前研究证实多种肿瘤细胞存在自噬缺陷，同时伴有大量 p62 聚集，并且与 NF-κB 调控有关。p62调控NF-κB主要有两种方式，其一是通过PB1结构域结合aPKC、ZZ结构域结合RIP，激活TNF-α信号介导的 NF-κB 通路；其二是通过 TB 结构域结合TRAF，形成p62-TRAF6-IKKβaPKC的信号复合物激活NFκB 通路。在此通路中，p62 与 MAPK 激酶激酶前端基本区域MEKK3结合作为活动中心募集 TRAF6 及其他聚合物。更重要的是，p62 与TRAF6 结合能促进其寡聚化，并增强TRAF6的泛素化，最终多聚泛素化的 TRAF6 能诱导NF-κB 的激活。信号接头蛋白 p62 能被原癌基因 ras 所诱导。在人类肿瘤中p62 水平升高，这是 Ras 诱导细胞存活和恶性转化所需。相反，p62（-/-）小鼠对Ras诱导的肺腺癌具有抵抗性。作用机制是 p62 诱导的 TRAF 多聚泛素化是 Ras 激发IKK所需，结果会造成p62缺陷细胞内活性氧水平升高，这可能与 p62 缺陷细胞死亡率增加和 ras基因致肿瘤性下降有关。
3.3、p62与胱天蛋白酶8介导的凋亡信号通路
凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡过程，在维持机体发育和内环境的稳定方面起着重要的作用。细胞凋亡可通过内外源两个途径触发，而胱天蛋白酶8主要与细胞外源性凋亡信号途径有关。
在外源性凋亡过程中，凋亡配体TRAIL与细胞膜表面的死亡受体 4（death receptor 4，DR4）和DR5结合后募集Fas 相关死亡域蛋白，通过DD聚集作用，死亡反应区端进一步募集到胱天蛋白酶8前体，最后形成死亡诱导信号复合物（death-inducingsignaling complex，DISC）。胱天蛋白酶 8 作为DISC的组成部分，能被cullin3泛素连接酶泛素化，泛素化的胱天蛋白酶8能与p62作用。随后，p62促进DISC复合物的聚集从而驱动细胞凋亡程序。细胞内 p62阳性聚集物可以作为一个决定细胞生存死亡的信号中枢：通过激活TRAF6-NF-κB 信号通路促进细胞存活；或通过促使胱天蛋白酶8和下游效应胱天蛋白酶8的活化，诱导细胞凋亡。
p62-核因子E2相关因子2（Nrf2）-抗氧化反应元件（ARE）信号通路. 细胞质中，一般Keap1-Nrf2通过Nrf2的泛素化被蛋白酶体降解；当细胞受亲电体（electrophile）或活性氧（ROS）刺激时，Keap1-Nrf2复合物解离，Keap1结合P62通过自噬降解，Nrf2进入细胞核内作用于ARE进而激活抗氧化基因和自噬相关基因表达。mTOR1：哺乳类动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白复合物1；P：磷酸化；ub：泛素化；TBK1：TANK结合激酶；CK2：酪蛋白激酶2
4、p62在疾病发生中的作用
在自噬相关性疾病如神经退行性疾病、肿瘤和炎症等都会出现各种相关调控蛋白和泛素蛋白的聚集物，而p62是这些聚集物的作用中心。
4.1、p62与神经退行性疾病
2002年，Ravikumar等最早提出神经退行性病变的发生与神经元自噬异常有关，短短十几年时间自噬已成为神经科学领域的研究热点。研究发现，阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）和帕金森病（Parkinsondisease，PD）等多种神经退行性疾病中都存在神经元自噬活性的改变。现有研究表明p62作为自噬接头蛋白与上述神经退行性病变发生直接相关。
亨廷顿病（Huntingtondisease，HD）是由于基因编码区CAG序列过度扩张，造成大量错误折叠蛋白（htt蛋白）聚集而引发的神经退行性疾病。已有研究发现，polyQ 蛋白的错误折叠导致神经元变性。Nagaoka等［11］研究早就提出p62可偶联polyQ蛋白，形成泛素化蛋白聚集物。然而，p62的作用机制迄今仍然不是很清楚。在 HD 小鼠模型中发现，敲除p62将增加胞质中polyQ蛋白聚集。这些研究表明，变性的htt蛋白可能通过p62聚集作用进行选择性自噬途径清除。
AD 是一种典型的神经退行性疾病，其病因主要包括tau蛋白过度磷酸化学说和神经细胞凋亡学说等。早在2001年人们就发现了p62和泛素化蛋白在AD患者神经元和神经胶质细胞中大量聚集。大量文献表明，AD与自噬性降解缺陷有关，p62通过UBA结构域连接多聚泛素化tau蛋白，引导其进入自噬体系统降解。然而p62和神经原纤维缠结、其他聚集物结合抑制了它降解泛素化 tau 蛋白能力，成为AD发病原因之一。越来越多的证据表明，线粒体功能障碍在AD发病机制中起着关键的作用。p62的PB1区域异常会阻碍损坏的线粒体清除。
PD是一种黑质多巴胺神经元进行性丢失的神经退行性疾病，突变的α-突触核蛋白以及泛素蛋白阳性路易小体的异常聚集是主要的病理特征。许多体内体外研究结果发现p62存在于路易小体聚集物中，α-突触核蛋白聚集物需要p62受体蛋白才能进入自噬-溶酶体清除。体外细胞实验同样表明，p62敲除导致错误折叠的α-突触核蛋白聚集物降解效率极大的降低。
4.2、p62与肿瘤
细胞自噬与肿瘤发生之间的关系存在双重性。一方面，在正常细胞和肿瘤细胞形成的早期阶段，细胞自噬起抑制肿瘤发生的作用，尤其是在肝肿瘤中表现得特别明显。如研究发现，atg5或atg7基因敲除小鼠会出现自发性肝肿瘤，而p62的堆积至少部分与肿瘤发生有关。因为当同时敲除p62时，atg7-/- 小鼠肝肿瘤体积明显变小。
在人类和小鼠肿瘤组织中发现了p62大量聚集以及自噬相关基因beclin1的缺失。如人类中至少 60%的肺腺癌和 90%的肺鳞癌中出现 p62 水平的升高。所有这些结果均支持自噬缺陷导致的p62聚集在肿瘤形成中起重要作用。细胞内p62聚集提高了患肿瘤的可能性，这可能同它激活了两个活性氧清除系统有关，分别是 Nrf2 和 NF-κB，最后使癌细胞存活下来。同时，p62积聚也使基因组不稳定从而促进肿瘤的发展。因此，通过激活自噬降低p62水平是一种有效的抗肿瘤策略，它既能阻断NF-κB转录活性，同时又下调Nrf2水平减少肿瘤细胞抗药性和提高肿瘤细胞死亡率。
然而一旦肿瘤形成后，自噬却能促进肿瘤细胞的存活和增殖。这主要是由于肿瘤细胞代谢旺盛，严重依赖于自噬来提供能量和营养需求的原因。考虑到自噬在肿瘤进展中的作用，抑制自噬活性也被作为在肿瘤进展阶段的一种肿瘤治疗策略。同时，由于p62能激活胱天蛋白酶8凋亡途径也可起到癌症治疗的作用。目前已观察到 p62 缺陷细胞中NF-κB 信号通路活性下降导致活性氧清除减少，最终能引起细胞内活性氧水平的升高和更多细胞发生凋亡。这也许能解释p62缺陷细胞肿瘤活性下降的现象。
4.3、p62与其他疾病
随着细胞自噬机制研究的不断深入，越来越多的研究支持 p62 参与了其他多种疾病如感染性疾病、遗传性疾病以及慢性疾病的发生发展过程。
当细胞体内侵入细菌时将会通过异体自噬起到保护作用。沙门菌属侵入细胞内，p62会在细菌周围聚集，p62 的 UBA 结构域（Ser403 位点）通过TBK1 激酶磷酸化，可增强 p62 易位使微生物形成泛素阳性包涵体；随后，p62的KIR结构域（Ser351位点）磷酸化，使Keap1进入泛素阳性包涵体，通过自噬途径将菌清除。
佩吉特病是一种遗传性疾病，主要特征是骨质破坏和重建过程交替发生，并伴有并发症出现。目前研究发现，p62的缺失会制NF-κB受体活化因子配体诱导的 NF-κB（UBA 区域缺失或突变）信号通路，将会导致破骨细胞异常的佩吉特病。
肥胖伴随着炎症的产生，p62通常抑制肥胖和提高能量消耗。已有研究表明，p62 可与 ERK1 和蛋白激酶 Cz 作用调节代谢平衡。p62-ERK1 调节成熟性肥胖和2型糖尿病，而p62-蛋白激酶Cz调节肥胖诱导的炎症和2型糖尿病。
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