流式细胞术原理

流式细胞术公开课

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1. 流式细胞仪

1.1 模型

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1.2 液流系统

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会形成鞘液流(鞘液是为了保证细胞在中间形成单个排列的细胞流,因为要保证激光覆盖整个样本中心流)在外周,样本流在中央的层流状态,使得样本仅在轴心


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激光照射到样本流上,激光60um宽,20um高(宽高有限,只有样本流刚好在中间才能保证激光能覆盖样本流细胞)


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样本流中的细胞表面的荧光抗体受到激光的照射以后,会被激发出荧光;

有两个镜头接受荧光信号,
一个是forward scatter-FSC检测器(前向散射光),另一个是side scatter-SSC侧向轴检测器/荧光信号检测器(与激光90度)


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收集到的光信号就被光纤传导到光分离系统中去了,

1.2.3光收集系统

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小知识:滤光片
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光信号手机系统的内圈是长通滤片


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中圈和外圈分别是带通滤片和PMT(啥?)


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刚才细胞经过激光照射会有四个重叠的光谱,x轴是波长,y轴是强度


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光收集系统的过程

第一步,通过长通滤片,光信号被切割


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第二步,经过带通滤片把特定波长的波过滤过来,不符合波长条件的波被反射


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第三步,经过过滤的波,经过PMT转变成电信号,


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1.2.4 PMT当中发生了什么呢

PMT元件是电信号检测分析系统,


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左边是光电转换膜,上下两边有不同的小电极,


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侧边有电子检测器,


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光信号转换成电信号的过程:
光子打到左边的光电转换膜上----> 膜上就会蹦出一个电子,这样就初步实现了光信号转变成电信号 ----> 电信号经过不同的电极就会反弹 ----> 电子经过反弹,电信号实现级联放大作用(通过调整电压可以调整最终的电信号大小) -----> 检测器上就会形成一个电脉冲

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表示电脉冲有三个参数:
峰宽+高度+峰下面积A;
常规的一般用峰下面积A来表示

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下面是经过电信号转换的信号强度值,反映了每个荧光信号的强度;
每一行就是一个细胞,


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怎么转换的呢?

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每一行代表一个细胞,每一列的数值784~10229代表每个特定的PMT的荧光信号强度值;


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两个PMT作为横纵坐标,可以根据荧光强度判定这两种荧光抗体结合细胞的比例;


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点图

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一个细胞在轴上就是一个点,每一个点就代表一个细胞的位置,横纵坐标分别代表两个通道PMT的强度(选取的两个PMT);
从下图可以看到黑乎乎的一团代表一种细胞,但具体的数字并不知道,为了弥补这个缺点呢,就出现了密度图


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密度图

细胞越多用不同的颜色(伪色)表示,可以看到红色中心的细胞最多,外周细胞少


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等高线图

把密度相等的点画成一条线


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直方图

横轴代表荧光信号强度,纵轴代表细胞数量


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小结

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