一、什么是同源重组？

        百度上说，同源重组（Homologous Recombination, HR) 是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatid) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

如何将同源重组运用到基因敲除小鼠上？

同源重组(homologous recombination)是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。

同源重组是多种生物体内普遍存在的一种生理现象，它是生物体用于纠正自身(DNA复制过程中产生)或因外界因素诱导所致DNA突变的一种内在机制，是基因敲除的分子生物学基础。

二、什么是CRISPR/Cas9？

        CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计crRNA和tracrRNA这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（single guide RNA），从而引导Cas9对DNA定点切割。

CRISPR系统包含两个组件，一个是sgRNA，另一个就是Cas 9蛋白。sgRNA是一个短的合成RNA，只有20bp大小，可以与Cas9蛋白结合，所以在设计sgRNA之前，应在基因组上寻找PAM序列（PAM：Protospacer Adjacent Motif），PAM序列是有固定形式的，来自于不同菌种属的Cas，它的PAM序列形式是不一样的。目前主流是SpCas 9（Cas 9蛋白来源于S. pyogenes （化脓链球菌）II型CRISPR系统）。所以，Cas9的PAM序列为-NGG的形式，“N”可以是A,T,C,G中的任何一个。Cas 9相当于是限制性核酸内切酶，使PAM序列前形成DSB（Double Strand Break）。所以，sgRNA其实相当于是向导，告诉Cas 9蛋白在哪进行切割。

为了提高CRISPR/Cas9 的特异性，使用Cas9切口酶和一对sgRNA，两个相近的切口造成DNA双链断裂，诱导细胞发生非同源末端连接修复，造成目的基因的突变。

sgRNA的设计?

利用CRISPR/Cas9进行基因的编辑，首先要构建有效的sgRNA。一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序。这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割的 20 个nt。而 PAM 序列的特征为 NGG。

sgRNA的设计原则

（1）sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。

（2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM序列前，PAM序列的特征为NGG（N可以为任意核苷酸），所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

（3）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。

（4）如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。

（5）全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。

（6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。

sgRNA通常通过网站在线设计，下面介绍介个常用网站共大家选择。

网站1：通过网址：https://www.deskgen.com/landing/cloud进行sgRNA的设计，进入网址后点击KNOCK OUT进入设计页面，输入想要设计sgRNA的名称后，进行sgRNA的选择。由于内含子在基因表达的过程中，不会进行表达且会被删掉，所以我们在设计sgRNA时一般在靠近启动子的第一个CDS区（也就是外显子的保守结构域）进行sgRNA的选择。在网站上，On-Target和Off-target都是有评分的，一般来说，评分越高，则sgRNA越好。On-Target其实就是sgRNA对目标位点识别后与DNA模板进行识别切割的的效率，所以准确性越高，On-Target的评分越高。Off-Target也就是脱靶效应，由于CRISPR技术的切割是由sgRNA根据PAM序列定位识别位点，从而进行切割，但是如果sgRNA识别的位点是错误的，就产生了错误切割，这样就产生了脱靶效应。所以说，在进行sgRNA选择的时候，要尽可能地选择脱靶效率比较低的，也就是Off-target分值比较高的。另外，符合sgRNA的其它设计原则就可以了。

网站2：打开网站 http://crispr.mit.edu，将基因名称，邮箱，第二外显子序列输入到对话框，点击 Agree and submit，等待网站设计成对的 sgRNA 序列。一般推荐网站设计，因为网站可以预测脱靶位点数，避免基因脱靶产生。

网站3：http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/这也是一个很常用且好用的网站~

在sgRNA引导下，Cas内切酶定点切割DNA双链而产生DNA缺口，然后生物体启动同源重组修复途径，当存在一段高度同源的DNA模板（Donor DNA）时，会以Donor DNA为模板进行修复，从而达到将目的片段定点引入基因组的目的。

三、什么是Cre/loxP？

        Cre-LoxP系统策略是进行基因组定点突变的新途径，可在DNA的特定位点上执行敲除、插入、激活、倒转及易位等。该系统在80年代被引入后，已被成功的应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞培养及小鼠身上。

        Cre-LoxP系统由Cre重组酶和LoxP位点两个部分组成。Cre重组酶是整合酶家族的一员，于1981年在大肠杆菌噬菌体P1中发现，是最常用的位点特异性DNA重组酶。Cre基因有1029个碱基，编码由343个氨基酸组成（约38kD）的Cre重组酶。该酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，可以识别特异的DNA序列（loxP位点），引起重组。LoxP位点是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定loxP的方向。经典的loxP位点序列如下所示：

        Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使两个loxP位点间发生基因重组。Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。

Cre-LoxP系统原理

当基因内存在loxP位点且有Cre重组酶存在时，Cre重组酶便会与loxP位点两端的反向重复序列区结合形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随之，loxP位点之间的DNA序列被Cre重组酶切开，切口通过DNA连接酶重新连接。DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置。根据loxP位点序列位置和方向的不同，特异性重组结果有以下三种情况：①当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相同时，Cre重组酶能够敲除两个loxP序列间的DNA片段；②当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相反时，Cre重组酶能够反转两个loxP序列间的DNA片段；③当两个loxP序列位于不同DNA链上时，Cre重组酶能够介导loxP序列间DNA链的交换或染色体易位。尤其要注意的是，Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程。

四、loxp小鼠的构建

        loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体，这种载体主要由3个部分组成：

①分别存在于打靶载体5和3’臂端，是与靶基因一定区域相同的同源序列，其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。

②位于5’和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲人的外源序列和选择标志基因。选择标志基因一般为neo―2A基因，含有两个选择标志：一个为G418抗性基因(neo)，为细胞提供针对G418的抗性，为正筛选标记；另一个为胸腺嘧啶激酶基因(tk)，可以把培养基中的更昔洛韦(ganciclovir)磷酸化为对细胞有毒的化合物，为细胞提供负筛选标记。

③3个loxP位点，分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基因的两侧。

    一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞，常选用位于同源序列边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取代型打靶载体整合进基因组的结果是靶载体中的序列置换掉基因组中的同源序列。

将打靶载体与gRNA和Cas9 mRNA一同注射到受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内。

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