富集分析方法
- ORA Over-representation analysis过表达分析，常见的是GO富集分析和KEGG富集分析；
- FCS functional class scoring功能集打分，常见的是GSEA；
- PT pathway topology通路拓扑结构分析，代表是SPIA；
- NT network topology网络拓扑结构分析；
ORA局限性：
1.有可能在多重假设检验后不存在具有统计学意义的差异基因存在；
2.又或者，具有统计学意义的基因很多，但并不富集于统一的生物学主题；相应的阐述可能冗长、主观，主要依赖生物学家的专业知识；
3.单基因分析可能丢失对通路影响的重要信息；细胞过程通常会对多个基因造成影响； 代谢通路中所有编码基因的表达增加20%对通路造成的影响可能比单个基因增加20倍更重要;
4.不同的课题组研究同一种生物现象时，得到的具有统计学意义的基因list的overlap很少；
GSEA的优势：
1.在基因集的水平上进行分析；
2.基于先验的生物学知识（基因集S）；
3.不具有统计学意义的基因也会考虑进去(Gene List L)；
4.目的：观察基因集S中的基因在L中是随机分布还是集中在top/bottom（预期是如果富集，会呈现出后面的分布）；
GSEA的步骤
1.ES（Enrichment Score）的计算
Kolmogorov-Smirnov test
- 详细介绍可参见
https://www.cnblogs.com/arkenstone/p/5496761.html- 以gseKEGG为例，K-S test检验的是，treat vs control（geneList-L）的分布与geneSet的分布是否一致，检验得到的结果是ES；
geneList为ID依据logFC排序所得，L中的基因在S中，sum increase，不在S中，sum decrease，最终得到的max|sum|即为ES；
2.ES 显著水平的计算
permutation test
- 详细介绍可参见：
https://www.plob.org/article/3176.html- gene_set permutation生成随机基因集(我的理解是，从geneList中随机抽取（number of genes in gene_set）个基因得到），产生ES(S, pi) ，集合所有ES(S, pi) 形成直方图，对ES的显著水平进行检验（p=percentage of ES(S, pi)>=ES(S)）；
p.vlaue的解释见：
https://www.jianshu.com/p/eede4ea05f59
3.多重假设检验校正
FDR
- FDR代表某个基因集的特定NES是假阳性的概率；样本量大（每组至少7个）的情况，使用sample_label permutaion，FDR的阈值建议是0.25，即4个假设中至少有3个是可用的；但如果样本量少的情况下，使用gene_set permutation进行分析，此时，FDR的cutoff应该更严格一些，比如5%；
- FDR是两个分布的比率：（1）permutation背景下，实际的ES versus 所有基因集的所有permutation的ES（2）实际基因集背景下，实际的ES versus 所有基因集的ES；例如，如果分析四个基因集并执行1000次permutation，则第一个分布包含4000个数据，第二个分布包含4个。
- 建立直方图（所有S和所有permutation），于某个NES（>=0）而言， FDR为NES（S，pi）>=NES的比例（permutation水平下），除以基因集水平下，NES（S）>=NES*的比例；
不咋华丽的分割线，结合上clusterprofiler的gseKEGG函数理解下：
gseKEGG
kk_gse <- gseKEGG(geneList = geneList,
organism = 'mmu',
nPerm = 1000,
minGSSize = 10,
verbose = FALSE)
-
organismgeneList对应的物种； -
nperm设置permutation的次数； -
minSize基因集中至少应含的基因数目； -
maxSize基因集中最多包含的基因数目；
kk_gse@result
-
Description通路名称； -
setSize通路中基因数目； -
pvalue对应该通路富集结果的p值，未设置seed=T的话，p值应是略微有变化的； -
p.adjust对p值进行校正，默认是BH方法，将基因集数据考虑进去了，即FWER；pvalueCutoff即p.adjust的cutoff为0.05； -
qvalues（是上述介绍的FDR？我没算，嗯，其实是我不会算，也没仔细研究） -
leading_edge
Tags：对ES 有贡献的基因的比例；
List：反应出ES于ranked list 中“登顶”得到最终的ES的位置；
Signal： N 指list中的基因数，Nh 指基因集中的基因数；
[参考内容]：
1.http://www.bio-info-trainee.com/2102.html
2http://bioinformatics.mdanderson.org/MicroarrayCourse/Lectures09/gsea1_bw.pdf
3.https://bioinformatics.cancer.gov/sites/default/files/course_material/GSEA_Theory.pptx
4.http://compbio.ucdenver.edu/Hunter_lab/Phang/downloads/files/GSEA.ppt
5.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1239896/
6.http://www.baderlab.org/CancerStemCellProject/VeroniqueVoisin/AdditionalResources/GSEA
7.https://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html
8.http://www.360doc.com/content/18/0303/21/45848444_734023872.shtml
9.https://www.jianshu.com/p/5a4bda169247
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