文献来源于19年的Nature Communication：RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail ，https://doi.org/10.1038/s41467-019-09865-9

记录一下文章的设计思路：

图1：EMT in cancer cells is regulated by m6A levels of mRNAs

体外用TGF-β驯化细胞并证明其处于EMT状态，LC-MS/MS证明m6A在EMT和普通癌症状态下的细胞中修饰水平不一致，用dot-plot辅助证明。（一共4个细胞系，2主要HeLa，HepG2，2补充，Huh7，A549）
只在一个细胞系（HeLa）中利用crispr突变转移酶Mettl3，发现其m6A水平降低。 表型实验划痕，体外侵袭同样受到抑制。（此外还做了sh和si重复）。利用qP和WB检测EMT相关基因的mRNA和蛋白表达情况，这里是MMP2和FN，E-cad。（同样做了4个细胞系）

过表达另一个酶ALKBH5（去甲基化酶），在HeLa中FN和MMP2的mRNA水平降低。WB发现相关蛋白的表达趋势和突变Mettl3相反。

接下来实验发现TGF-β导致的E钙粘下降和FN上升这种现象，由于m6A甲基化酶被突变后，E钙粘和FN的表达回补（与con没有显著差别）了。

在TCGA数据里面看肝癌和正常样本的METTL3表达情况，在肝癌中更高。这里用病人和其匹配的正常样本来看的。 在总的肝癌样本中，CDH1和METTLE3的表达成负相关

结合生物学知识，已知TGF-β通过Smad2/3会和METTL3-METTL14-WTAP复合物作用诱导mRNA甲基化。用LC/MS/MS检测用Smad2/3抑制剂SB431542处理后的HeLa细胞，发现由于TGF-β诱导m6A的水平上升被阻滞了。

以上全部数据说明mRNA的m6A水平会调节癌细胞的EMT进程

图2：Variations of m6A-regulated genes in cells undergoing EMT

m6A-seq绘制EMT细胞的甲基化组（至少要有2组重复）。m6A motif CGAC在各组的情况。 m6A peaks的归属，比如5' UTR，CDS，终止密码子和3'UTR上面 (peak density)。在出现EMT和control的细胞中（即TGF-β处理组和原始组）发现不同的m6A peak分布，某些修饰是新出现的，某些消失了。 对m6A unique的基因进行富集分析，发现其在adheres junction等上面富集。

图3：Snail is involved in m6A-regulated EMT in cancer cells

取交集，EMT相关基因84个(MSIGDB)，m6A-seq在EMT细胞中高表达（>2 logfc）61个。确定一个关键靶基因SNAI1，并可视化m6A-seq在该基因的富集结果（富集在CDS和3'区域）。随后用m6A RNA免疫共沉淀(RIP)-qPCR验证结果可靠性。有意思的是还找了一个ZEB1作为negative control，用来说明没有被富集？（Sfig）

在WT和敲掉Mettl3的细胞系里面用WB验证，发现Snail蛋白水平下降，阴性对照（没有甲基化修饰的基因）蛋白水平基本不变，同时在转染AKLBH5（过表达）和对照组的HeLA中进行WB，发现同样的趋势。

确定这个情况后，在TGF-β处理过的细胞系里面进行transwell实验，分别设计对照、敲掉Mettl3、pcDNA过表达Snail和Mettl3敲掉+pcDNA四组，发现敲掉Mettl3细胞体外迁移能力降低，但是过表达snail回补，证明了snail在Mettl3的甲基化介导下发挥促转移的功能。最后,WB实验发现过表达Snail后，敲掉METTL3的细胞中，FN下降，E钙粘上升，这两个基因的现象和转移能力减弱有关。

图4：m6A triggers translation of Snail mRNA in cancer cells

前面是表型，从这里开始做机制研究

先看WT和敲METTLE3后，Snail的前体、成熟mRNA的表达量，惊讶的发现其不降反升了（和蛋白水平出现显著差别）。验证了promoter activity发现敲没敲的能力一样，这个结果说明Snail的转录不受m6A影响（？敲掉了后mRNA水平反而上升，虽然启动子的功能不受改变）

核质分离结果发现，WT和敲掉METTL3细胞系中，SNAI1 mRNA在核内、胞质中分布差不多。

利用Act-D抑制转录，发现前体和成熟mRNA的半衰期在WT里面比敲掉METTL3的细胞系低。即m6A修饰引起Snail前体mRNA剪接和成熟RNA的降解（引起剪接的结论是如何得到的？）。随后用YTHDF2，一种甲基化酶reader来看成熟Snail mRNA上的甲基化水平随时间变化，作为补充。

敲掉NETTL3后，SNAI1成熟的mRNA水平上升，但是蛋白水平却下降了，于是假设这种现象与蛋白稳定性或翻译效率的差别有关。随后在WT和敲掉Mettl3的细胞系中用蛋白翻译抑制剂cycloheximide（CHX）处理。WB显示两组蛋白降解情况差不多。预处理，用MG132抑制蛋白酶体活性或者CHX阻滞蛋白质翻译，再用TGF-β处理敲掉METTL3的HeLA。结果显示，CHX而不是MG-132减缓了敲掉METTL3中，TGF-β诱导的Snail表达。 已知TGF处理的细胞处理EMT状态，这个状态下snail甲基化更强，这里蛋白酶体抑制剂的功能就是不让甲基化酶甲基化snail的mRNA，但其蛋白水平上升了。翻译抑制剂CHX处理后没有明显相关性，说明TGF-β诱导的snail甲基化和增强其翻译的功能相同。（有点晕，很复杂）

创建了pmirGLO-Snail的双重-luciferase报告系统，发现Snail的翻译效率在敲掉METTLE的HeLa细胞中显著低于WT，提示m6A诱导的Snail表达与翻译调控相关。

随后，进行多核糖体图谱，结果显示敲掉METTL3后，非转录区域（<40S)升高，单核糖体(80S)以及转录活性多核糖体(>80S)下降。qPCR显示，对比WT，在敲掉METTL3的细胞中，多核糖体上的Snail mRNA显著降低。意味着敲低了METTL3，导致Snail mRNA甲基化水平降低，翻译效率下降。随后在TGF-β处理过的细胞上重复核糖体图谱实验，发现其诱使的m6A甲基化升高，导致polysome(>80)上面Snail mRNA升高（翻译升高）。 为了证明这个翻译效率的提高是否是mRNA加帽/不加帽调控的，用rapamycin（已知加帽翻译，对不加帽翻译不起作用）来处理METTLE敲除和WT细胞系。两者的蛋白水平没有明显区别。用CHX和rapamycin共处理WT细胞，Snail迅速降解，意味着rapamycin处理的细胞Snail1表达稳定，与蛋白质稳定性增加无关，而是与加帽翻译有关

图5：m6A-methylated CDS regulates translation of Snail

在Snail mRNA的一个CDS区域和2个3’UTR区域鉴定出了m6Amotif GGAC，用m6A抗体从HeLa细胞分离的RNA片段做免疫共沉淀（IP）。发现Snail mRNA的m6A水平，从高到低分别是CDS,3'和5'UTR（这个怎么做到的？用不同区域的引物去P吗？）。为了深入研究m6A甲基化在SNAI1的3‘UTR区域上的作用，构建了luciferase报告系统，结果证明WT、MUT1、MUT2的3’UTR没有翻译差别。

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共转染ALKBH5也没有改变WT、MUT1、MUT2的表达水平。因此m6A在3‘UTR上面可能不参与m6A介导的Snail 表达调控。

之后构建了snail CDS expression construct (表达载体，只包含重组蛋白的编码序列)，并将其和pcDNA/ZEB1（阴性对照）共转。结果显示METTL3敲掉细胞的Snail表达显著下降，ZEB1没有收到影响。接下来构建了2个CDS的A到C突变，mut2作为对比。

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mut1的snail水平对比WT和mut2，受影响的程度不显著（这个地方不能被甲基化了，但是蛋白水平相对上升了，这里一个tricky的地方是，相对光学密度，在WT里面突变CDS的mut1难道不会降低它的蛋白水平？）

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然后用TGF-β处理共转染后的细胞，WB结果显示mut1的Snail水平相对于mut2来说变低了（相对是con/TGF-β in CDS-Mut1 vesus. con/TGF-β in CDS-Mut2这么来算的吧？）。这些结果说明CDS区域才是甲基化主要调控区域。

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YTHDF1是m6A的read蛋白，用RIP-qPCR研究SNAI1和YTHDF1的相互作用。YTHDF1在SNAI1 mRNA上富集，但是在敲掉METTL3的细胞中富集程度被抑制。同时发现YTHDF1与snail的CDS区域作用比3‘UTR区域的更紧密。为了确认YTHDF1在m6A调控Snail表达的作用，用si敲掉了YTHDF1，发现敲掉后会缓解HeLa细胞中因TGF-β诱导的Snail表达。同样，过表达YTHDF1有相似的效果。

真核生物中的translation elongation由eEF-1和eEF-2实现，在这里也看了一下。Snail mRNA和eEF-2的结合在敲掉METTL3的细胞系中对比WT显著下降，eEF-1没有显著。co-IP结果与结论一致。上述结果表示，YTHDF1和eEF-2对于Snail mRNA的m6A诱导翻译延长相关。

图6：m6A regulates in vivo cancer progression

动物实验。皮下注射sh-control和sh-Mettl3 Huh7细胞系。做免疫组化结果看Snail，FN，Vim的蛋白表达水平。尾静脉注射数肺肿瘤数量，结果与上述一致。 再构建HeLa WT和METTL3敲除，过表达snail的HeLa和敲除METTL3过表达Snail的HeLa。发现敲掉METTL3后，肺肿瘤数量减少，而过表达snail可以缓解敲掉METTL3的抑制作用。

最后在临床上面看了METTL3和YTHDF1在肝癌组织和对应的正常组织中的相关性改变。同时看了分期情况、生存预后数据。购买了一批组织芯片，观察IHC中METTL3和SNAIL的相关性。