1. PCR：（聚合酶链式反应）是通过PCR仪，模拟DNA半保留复制，从而体外快速扩增DNA的方式。
一、基本过程
典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。
因此所谓的PCR仪，其实就是一套自动温控系统
高温变性：95℃左右时DNA双链打开的过程，使之能够与引物结合，为下面的反应做准备。这个过程大约需要5 min左右。
低温退火：就是适宜条件下冷却的过程，变性后的单链与引物通过碱基互补配对，再次形成局部双链。更准确的来讲应该叫复性，恢复双链的过程。
中温延伸：模板-引物接头之后，延伸就是在72℃、TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶向序列为模板，碱基互补配对为原则，再次合成完整的双链DNA的过程。
我们可以看到这里复制之后实际上有一条链是新合成的，另一条则是原先就存在的，因此说这叫半保留复制。
二、聚合酶链式反应的组成成分
1.模板（1 ng/μL）
模板DNA可以从各种生物组织中得到，通常浓度为1 ng/μL。浓度不是越高越好，浓度太高会导致大量的非特异性结合。
2.引物（10 μmol/L）
引物浓度通常是10 μmol/L。
引物浓度太低，产量较低；
引物浓度太高，引起错配、非特异性以及引物二聚体。
3.Taq酶（5 U/μL）
U是酶活力单位，定义为：25℃下（其它为最适条件），1分钟内能转化1 μmol底物的酶含量，或是转化底物中1 μmol有关基团的酶含量。
4.dNTP（2.5 mmol/L）
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，从而影响DNA聚合酶的活性。
5.Buffer（含Mg2+）
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
Mg2+浓度过低会使DNA聚合酶活性降低，PCR产量下降。
Mg2+浓度过高会使特异性降低。
三、聚合酶链式反应的体系
| 50uPCR体系 | # |
|---|---|
| H2O | 50u － 其他的量 |
| Buffer | 稀释至1×（如5×Buffer取10u） |
| Mg2+ | 稀释至1× |
| dNTP | 1u |
| 上游引物 | 1u |
| 下游引物 | 1u |
| DNA聚合酶 | 1u |
| 模板 | 2u |
| PCR程序设定 | 温度 | 时间 |
|---|---|---|
| 1.预变性 | 95℃ | 5min |
| 2.变性 | 95℃ | 10s |
| 3.退火 | 比引物Tm值低5℃，通常45-55℃ | 30s |
| 4.延伸 | 72℃ | 1000bp/min |
| 循环 | 2-4步循环30次 | |
| 5.保存 | 4℃ |
四、聚合酶链式反应的结果
对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测
2. 医院送检样品荧光PCR的流感检测
一、 实时荧光定量PCR原理
Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。
目前根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质不同，将其分为荧光染料和荧光探针两类。
荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。
当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。
TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。
二、流感标本检测流程
1. 分装病毒
保存于进口EP管，300u 一个
封装前充分震荡保存液
2. 机提核酸
- 准备深96孔板、试剂盒、样品300u、阳性对照（fluA、fluB）
- 96孔板中加入：
第一列：裂解液300u、PK10u、AC4u、磁珠10u、样本（最后加）
第二列：Wash Buffer Ⅰ 500u （用前混匀）
第三列：Wash Buffer Ⅱ 500u
第四列：Wash Buffer Ⅲ 550u
第五列：空
第六列：Elution B 30u - 最后先加样品，后加阳性对照；移液枪吹吸混匀。
- 充分反应10分钟后，上机器
3. 准备体系：25u
要分别准备fluA和fluB的体系
- T： 5u
- 5×buffer : 稀释至1×，也就是 5u
- dNTP：1u
- 引物 F: 0.2u；R:0.2u
- probe：0.2u （现配现用，母液1：10稀释）
- E ：1u
- 水：剩余的：12.4u
4. 上机
- 将提取出的核酸与此前配好的体系分装入八连管中
- 注意：不要有气泡
3. 流式细胞术
一、基本概念
流式细胞仪，样品细胞和荧光染料是流式细胞术的三大要素
流式细胞术检测的对象是呈独立状态悬浮于液体中的细胞，不能直接检测组织块中的细胞，必须先用各种方法将脏器或者组织制备成为单细胞悬液，然后标记上荧光素偶联抗体，才能够被流式细胞仪检测。
流式细胞术应用领域极其广泛，特别是免疫学，临床医学［3-6］，现在流式细胞术还能够辅助多种疾病的这段，尤其是白血病的诊断和分型。
二、流式细胞仪
流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
三、流式细胞仪的基本组成
各种型号的流式细胞仪虽然差别较大，但是基本结构是相同的，一般分为:液流系统，光路系统，检测系统和分选系统［7］。分析型流式细胞仪主要由前面的三个系统组成，分选型流式细胞仪比分析型细胞仪多了一个分选系统。
1.液流系统
液流系统由两套紧密联系而又相互独立的液流组成，即鞘液流和样品流。鞘液流从鞘液筒开始，通过管道进入喷嘴，经喷嘴的小孔形成稳定的可见的液流。鞘液最基本的特征就是等渗，保证处于鞘液中的细胞不会因为低渗或者高渗而死亡。样品流是上样分析的含有样品细胞的液体流，样品流开始于样品管，经过特定的专门管道进入喷嘴，然后与鞘液一起从喷嘴口射出形成可见液流，最后经过废液孔流入废液桶。上样分析时，两种液体虽然互相接触，却没有互相混合在一起，而是形成层流，样品流在中间，鞘液流在外围，而且两者所受的压力也不一样。操作者可以通过调节样品正压和鞘液正压之差来控制上样的速度，样品的正压和鞘液正压之差越大，可见液流中样品流的直径就越大。上样分析的速度就越大。
2.光路系统
光路系统开始于激光器，激光器是流式细胞仪的必需组成元件之一，不同的激光器发出的激光照射到细胞之后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收，流式细胞仪需要通过光路系统，根据不同的接收通道接收，然后通过信号的强弱间接反映细胞的物理化学特性。
光路系统是由一系列的透镜，滤光片和小孔组成，根据波长的不同分离各种光信号，其中滤光片尤其重要。根据功能的不同，可以分为长通滤片，短通滤片和带通滤片三种。长通滤片功能为:波长大于特定波长的光可以通过，波长小于该波长的光被反射。短通滤片的波长小于特定波长的光可以通过，波长大于该波长的光被反射。带通滤片的功能为:波长在某特定范围的光可以通过，波长在该范围以外的光被反射。
利用不同的类型的滤光片，将混合光信号分为六个不同的光信号，进入不同的六个通道，分别为SSC通道，FIFC通道，PE通道，PE-TxRed通道，PE-Cy5通道和PE-Cy7通道。
3.检测分析系统
流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出的样品群体中细胞的物理化学特征。这里必须提到光电倍增管的概念。通过滤光片根据波长的不同分离的光信号最后进入各自呢通道，也就是各自的光电倍增管。光电倍增管的功能主要为:将光信号转变为电信号，同时通过一定的比例将信号放大。
流式细胞仪的通道根据光信号性质的不同可以分为散射光和荧光通道。散射光通道是接收散射光的通道，即前向角散射光（FSC）通道和侧向角散射光（SSC）通道。荧光通道的命名方式是该通道主要接收哪个荧光素的荧光，就根据该荧光素的名称来命名。例如FITC通道，接收488nm激光激发后的荧光信号，波长510-550nm的荧光信号，所以，当细胞被超级FITC偶联抗体时，该通道所代表的信号就是FITC的信号，该通道接收的荧光信号越强，表示细胞上结合的FITC荧光素越多，为了方便，该通道被命名为FITC通道。此外，以主要荧光素命名的通道并不是只接收这一种荧光素被激发的荧光信号，其他的荧光素被激发后的荧光信号也可以被通道所接收和分析，如FITC通道，它也可以接收GFP和CFSE被488nm激光激发以后的荧光信号。
散射光信号和荧光信号经过光电倍增转为电子信号后，是以电子脉冲和电子波的形式被计算机系统接收和分析的。电子波的比较大小主要有三种方式，即电子波的长度，宽度和面积。这三个参数都可以反映光信号的大小，但是参数面积代表电子波的大小要比长度和宽度更加准确。
4.分选系统
分选式流式细胞仪比分析型流式细胞仪多一个系统，流式分选系统。分选型流式细胞仪能够从样品细胞中分离出目标细胞，回收后可以再培养，即，分选之后的细胞是具有活性的，无菌条件下的细胞。
四、流式分析的应用
1.免疫表型分析的应用
检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态(淋巴细胞是机体免疫系统功能重要的大细胞群，在免疫应答过程中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群。当亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化［10-11］。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开来，并计算出它们相互间的比例，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，并指导治疗)。
2. DNA含量及细胞周期分析
细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化［12］。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.应用于：肿瘤的早期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分布和疗效监测。
3.定量分析
检测细胞特异性标记物：FCM不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原定簇的个数。
