细胞体外培养过程中, 常见的污染包括细菌污染、霉菌污染及支原体污染, 还有细胞间的交叉污染。细菌和霉菌污染在显微镜下甚至是肉眼就很容易识别。细菌污染时, 培养瓶中的培养液变酸、变浑浊, 显微镜下, 细胞间大量活跃运动的细小颗粒, 细胞大量死亡。霉菌污染时, 严重时可见霉菌团块, 漂浮在培养液中, 显微镜下可见不同形态的霉菌菌丝。只有支原体污染, 较难识别。常常对培养细胞的支原体的污染估计不足或被忽略。
细胞感染支原体后, 可使细胞增殖缓慢, 部分细胞变圆, 从培养瓶壁脱落。多数细胞感染后, 生长速度、细胞形态等 无明显变化。 特别是一些肿瘤细胞系株, 虽然有支原体污染, 细胞仍生长迅速, 培养上清仍清亮。有些细胞支原体污染后, 形态变化虽不明显, 但培养液 pH 变化明显, 更换培养 液后几小时内变酸( 颜色变黄) 。还有的细胞支原体污染可有明显的改变, 如生长速度减慢, 甚至停止, 细胞体积增大, 细胞碎片越来越多, 培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积, 细胞无法传代。支原体污染对培养细胞功能方面的影响, 尚未见专门的研究报道。但确曾有报道有的实验结果仅能在支原体阳性 的细胞中得到。也曾有科研人员向我们反映:以前用支原体 阳性细胞得出的结果, 在相应的无支原体的细胞中不能重复其结果。也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆抗体实为针对所污染的支原体的抗体。 还有的科研成果, 他人无法重复, 也因所用细胞有支原体污染所致。
支原体检测的方法主要有培养法、荧光法、电子显微镜法和聚合酶链反应( PCR) 法。美国食品和药品管理局( FDA) 及欧洲要求必须进行培养法及利用指示细胞进行的 DNA 荧光法的检测。 这两种方法特异性和敏感性都很好, 但实验周期太长。抗体荧光法准确性不够。PCR 法以其准确、快速及操作方便, 做为筛选方法已被越来越多的实验室使用, 培养法可作为后备。
支原体清除方法:用药物抑制支原体的生长, 通过细胞 传代, 去除支原体。 常用的药物是针对支原体的抗生素, 如 BMC1 ( pleuromutiline derivative ) 和 BMC2 ( tetracy cline derivative) 联合使 用, 或 使用 CIP( ciprofloxancine hydro chlo ride) 。 将细胞培养在无抗生素的培养基中, 加入各种针对 支原体的抗生素, 连续培养 7 d, 做为一个循环, 一般需3个或更多个循环。培养结束时, 再进行支原体检测, 连续数次均为阴性, 即可证明支原体已被清除。因目前所使用抗生素 的限制, 撤药后, 经一段时间, 支原体往往又重新出现。
在科学研究和开发研究中, 避免支原体污染及减少支原 体污染对科研、开发工作影响的最好方法就是定期对培养的细胞进行支原体检测 。 这种常规支原体检测可最大限度降 低支原体污染, 确保排除未知支原体与细胞相互作用而产生 的严重后果。 尤其是在研究领域, 常忽视培养细胞中支原体 的污染, 或对支原体污染程度估计不足。 迫切需要提高认 识, 加强对培养细胞支原体污染的检测。
在日常细胞培养工作中可采用以下几点来控制支原体的污染问题:
1 .从可靠来源引进、使用细胞, 特别是知名的信誉良好 的专门机构, 如 ATCC 、基础医学细胞中心等, 这些机构对细 胞质量进行一系列检测。
2 .预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度, 按照规范的实验程序操作。 特别提醒一般实验室可从戴口 罩、帽子做起。
3 .定期对实验室中的培养物进行支原体检测。 这也是 国外一些重要实验室的经验。 一旦发现已经污染支原体的 培养物, 灭活后弃之。 更换新的培养物。 避免支原体的进一 步播散。
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