EPIC
https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1/
EPIC可根据表达数据分析出8种免疫细胞的浸润比例，分别是：B细胞、 肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、CD4+T细胞、 CD8+T细胞、 内皮细胞、 巨噬细胞和NK细胞。
其中，CAFs是肿瘤微环境的重要组成部分，有抑制免疫细胞的功能。可通过分泌生长因子如血管内皮生长因子、血小板衍生因子或其他趋化因子促进肿瘤生长和转移。
重要的是，这个工具的使用方法相当简单粗暴，只需要3步:
1. 提交RNA-Seq表达数据；
2. 设置参数
2.1 选择参考配置文件：血液细胞或肿瘤浸润细胞
2.2 选择结果类型：细胞比例（Cell Fractions）或mRNA比例（mRNA Fractions）
3. 每次运行添加个任务名字（Job name），点击Run EPIC。
Run结束后，网站提供结果的table和figures展示，也提供结果的下载。在table里，同时提供检索框，可直接查询感兴趣的检索结果。
研究者可以直接在运行结果后分析各种细胞组分在样本中的差异，当B细胞、CD8+T细胞、NK细胞比例显著下降时，表明组织中的免疫反应被抑制了，免疫细胞的招募过程受到阻碍，肿瘤免疫受到抑制；相反，CAF的增高则与肿瘤的发生发展密切相关。
CIBERSORT
https://cibersort.stanford.edu/
这是目前引用次数最多的免疫细胞浸润估计分析工具，2015年首次发表于Nature method。
CIBERSORT是基于线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的一个工具，可用RNA-Seq的数据来估计免疫细胞浸润情况，目前为止只提供网页版。
用户只需要注册一个账号，就可获得500M存储数据和结果的空间。操作时，只需上传标准的表达矩阵文件即可分析免疫浸润；如果想要分析包含其他细胞类型的浸润比例，则需按照官网提示的格式上传相应的文件。
在所有需要用户提交的参数和文件里，下图是最重要的
首先，工具提供“相对模式”和“绝对模式”。相对模式是指所有的免疫细胞的浸润比例分数之和为1，而绝对模式是指每种免疫细胞浸润的绝对分数。
默认情况下，工具只运行相对模式，当用户勾选绝对模式时，则先计算绝对模式，再根据绝对模式的结果计算相对分数，而这个相对分数的结果可能与只运行相对模式的结果存在偏差。
当这两个结果存在明显偏差时，用户应该取消同时运行绝对模式和相对模式。考虑到目前绝对模式的算法尚不成熟还处于测试阶段，个人建议直接运行相对模式比较稳妥，结果的可靠性相对更高。
其他的参数选项都用默认的即可，再添加一个“Name for custom sig file”的名称，有助于识别每次运行的工作内容。各项参数提交后，选择“Run”开始计算。最后的计算结果，可以在Menu的Job Results栏查看。用户可以重新run结果或者下载结果。
用户点击Actions里的九宫格按键，可以查看热图形式展示的结果。
至于结果的分析也就比较常规了，一般而言都是以不同特征分组然后比较，如比较正常和肿瘤组织中的免疫浸润差异，也可以比较有无某种基因突变的样本间免疫浸润的差异。
说到这里，也需要提醒大家，免疫细胞的浸润其实是一个未知的状态，测序时的组织样本是很多种细胞的混合物，不同的软件基于不同的算法，计算出来的结果之间存在一些偏差是再正常不过了的事情，至于谁的更准确一些，目前为止仍然是一个不可证伪的事情，所以在选择工具的时候就仁者见仁智者见智啦。
